調製及び器官胸腺スライス培養の応用
Summary
我々は、フローサイトメトリーと組み合わせて、T細胞の開発の正および負の選択をモデル化するために使用することができ、胸腺切片の調製を記載します。胸腺スライスはまた胸腺細胞遊走、局在のその場での分析のために適合され、そして免疫蛍光及び二光子顕微鏡検査を介してシグナル伝達することができます。
Abstract
機能性、自己寛容T細胞レパートリーの生成をもたらすユニークかつ高度に組織化された胸腺微小環境における胸腺の選択に進む。T系譜コミットメントと開発を研究するためのin vitroモデルは、このプロセスに貴重な洞察を提供してきました。しかしながら、これらのシステムは、T細胞の発達に必要な完全な三次元胸腺環境を欠いており、従って、 インビボ胸腺選択の不完全な近似値です。モデル化T細胞の発達に関連した課題のいくつかは、完全にT細胞を開発する胸腺選択をサポートする完全な胸腺の微小環境を提供し、その場モデルで使用することによって克服することができます。胸腺スライス器官培養物は、 その場での技術に存在補完します。胸腺スライスは、胸腺皮質と髄質領域の整合性を維持し、定義された発生段階の、または内因性のT cのオーバーレイ胸腺細胞の発達を研究するためのプラットフォームを提供します成熟胸腺微小環境内ells。マウスあたり〜20のスライスを生成する能力を考えると、胸腺のスライスは、ハイスループット実験のための拡張性の面でユニークな利点を提示します。さらに、多様な遺伝的背景は異なる胸腺サブセットまたは他の細胞集団をオーバーレイする胸腺スライスと可能性を生成する際の相対的な容易さは、この方法の汎用性を高めます。ここでは、胸腺スライス、単離および胸腺細胞のオーバーレイ、およびフローサイトメトリー分析のために胸腺スライスの解離を調製するためのプロトコルを説明します。このシステムは、非従来型のT細胞の発達を研究するだけでなく、胸腺細胞の移行、胸腺間質細胞の相互作用、及び二光子顕微鏡で胸腺の選択に関連するTCRシグナルを可視化するために適合させることができます。
Introduction
T細胞は、それらが機能的な、自己寛容T細胞レパートリー1-3の発生を確実にいくつかのチェックポイントが発生したその間胸腺における発生中間体の一連の分化します。正の選択は、皮質胸腺上皮細胞（CTEC）2,3上の主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）によって提示された中程度の親和性、ペプチドに低いと、認識することができるT細胞受容体（TCR）との胸腺細胞の生存を促進します。負の選択と制御性T（T REG）細胞の発達は、MHC 2,4によって提示される自己ペプチドに強く反応胸腺細胞の排除や流用を介した自己寛容の確立に貢献しています。未熟CD4 + CD8 +選択プロセスは、成熟T細胞亜集団に分化渡すTCRを発現しているダブルポジティブ（DP）胸腺細胞、MHCクラスであるの大半はI制限CD8 +細胞傷害性二次リンパ器官1-3エフェクター機能を実行するために胸腺を終了する前に、またはMHCクラスII拘束性CD4 +ヘルパー単一陽性（SP）T細胞。
T細胞発生の複雑さに加え、動的移動および間質細胞網5-9を通して胸腺細胞を発生する細胞の出会いです。これらの間質細胞は、胸腺細胞の開発に異なる役割を果たし、差動で正と負の選択が10を発生する胸腺皮質と髄質領域の間に分布しています。正の選択は、主に皮質で行われますが、DP胸腺細胞は、髄質に移動し、彼らは髄質は、正の選択および系統の完了に必要な追加の信号を提供することができることを示唆している成熟T細胞に分化する前に、TCR信号を必要とし続けることを蓄積証拠があります分化11,12。さらに、自己反応性胸腺細胞13,14の削除を促進する組織限定抗原を発現し、現在専門の髄質胸腺上皮細胞（MTEC）の存在にもかかわらず、負の選択の大部分は、遍在樹状によって提示された自己ペプチドを発現するために応答して、皮質で発生しますセル15,16。このように、T細胞の発達の正確なモデルは、胸腺細胞や間質細胞間の相互作用を促進し、これらの細胞は、正と負の選択を受けるよう胸腺細胞の移行をサポートし、無傷の皮質と髄質領域で、高度に組織化胸腺微小環境を提供する必要があります。
正および負の選択を研究する手段として、胸腺細胞のex vivo分析を補完するために、 インビトロ、インサイチュで 、およびT細胞の発達のin vivoモデルの数は、17-22を開発されてきました。要約する難しいことで知られています正のin vitroでの選択が、Notchリガンドを発現している間質細胞と幹細胞集団またはT細胞前駆体の共培養、特にOP9-DL1 / 4細胞は、へvitroモデルで非常に貴重なそれを作るT系譜コミットメントと制限された正の選択をサポートする機能を持っています研究T細胞の発達23-25。このシステムの限界は、しかしながら、これらの細胞が胸腺ストローマ細胞に見出される固有のペプチド加工機械や三次元の胸腺の微小環境を欠いているという事実が挙げられます。
しかし、より技術的に面倒な、 その場でおよび胸腺選択のin vivoモデルにおける in vitro系に関連する障壁のいくつかを克服することができます。再凝集胸腺器官培養（RTOC）は胸腺細胞と胸腺ストローマ細胞18,26,27の定義された混合物を含有します。これらの胸腺上皮細胞の再凝集は、MHCクラスIおよびII発現を維持し、developmeをサポートすることができNTの両方の従来のT細胞サブセットの、それでも定義皮質及び髄質構造を欠いています。胎児胸腺器官培養（FTOC）はlymphoreplete胸腺ローブにlymphodepleted胸腺ローブのハンギングドロップ培養を介して、または胸腺細胞の注射を介して胸腺細胞を播種することができ、T細胞の発達の人気モデルであり、CD4 +およびCD8 + Tの効率的な開発を支援します文化18,28-31の経時細胞。胎児胸腺葉の培養の開始時mTECsの不足はありますが、定義された皮質と髄質の構造は、条件に応じて時間をかけて開発することがあります。重要な考慮事項は、このモデルは、優先的に、成人T細胞の発達に対する胎児サポートすることができるということです。最後に、成体マウスで定義された胸腺前駆体の胸腺内注入は技術的に困難であるが、明らかにサポートするための環境を提供します in vivoでの T細胞の発達。 その場およびde vivoモデルでこれらは、優れたツールのトンですO研究T細胞の発達およびその使用は、実験ごとの実験に基づいて考慮されるべきです。
胸腺スライスは、しかし、最近ではユニークな、複雑で、一般的により高いスループット実験に対応するために、可能性とその場で胸腺選択を研究するための汎用性、補完的なモデルとして浮上しています。胸腺のスライスは、皮質と髄質領域の完全性を維持し、開発だけでなく、効率的なポジティブ及びネガティブ選択11,32-39時に胸腺細胞の移行をサポートしている間質細胞のフレームワークを提供します。胸腺のスライスの上に追加された胸腺細胞のサブセットは、組織内およびそれらの適切な微小環境ニッチ34,37に移行します。オーバーレイ胸腺細胞は、コンジェニックマーカーまたは蛍光標識を介して胸腺スライス内因性の細胞と区別することができ、数日間培養物中に維持することができます。胸腺スライス器官培養物は、様々な側面を研究するために使用することができます特に胸腺の選択、胸腺細胞の挙動（遊走と細胞の相互作用）、および胸腺細胞の局在化を含むT細胞の発生、の。マウスあたり〜20胸腺スライスを生成する能力が与えられ、実験のスケーラビリティは、胸腺選択の現場モデルにおいて 、一般に、他よりも大きいです。細胞死および封入膜の欠如を介して経時的に細胞の喪失による胸腺切片の調製は、ビブラトームように、特殊な装置を必要とし、培養物中の胸腺スライスの寿命が限られているが、胸腺スライスが優れたモデルを提供します成熟胸腺微小環境内の胸腺細胞の同期集団の胸腺選択の分析のため。ここでは、胸腺細胞の単離およびオーバーレイ、胸腺スライスの準備（胸腺を収穫含め、胸腺ローブのアガロース埋め込みおよび包埋組織のビブラトーム切片）を記述し、フローサイトメトリー分析のための胸腺スライスの解離。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、胸腺スライスとフローサイトメトリーによるオーバーレイ事前選択MHCクラスI拘束性TCRトランスジェニック胸腺細胞の効率的な正と負の選択の代表的な結果を調製するためのプロトコルについて説明します。このシステムは、アゴニスト抗原、ネガティブ選択および胸腺のTreg開発11,12の存在下で、事前選択DP胸腺細胞32からのMHCクラスII拘束性CD4 +…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Josée Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) and Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.
Materials
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated – T12) | Polyciences | 18986 | 22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100X | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
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