세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

Summary

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Abstract

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

시험관 내에서 조직, 기관 또는 시스템의 연구는 다세포 유기체를 포함하는 여러 세포 아형 사이에 존재하는 매우 복잡한 관계를 단순화하기위한 시도이다. 실제로, 시험 관내 연구는 가능한 하나의 세포 집단에 대한 자세한 이해를 취득 할 수 있습니다. 1) 쉽게 휴대 환경을 조작 할 수 2) 능력 세포 상호 작용을 감소하고, : 시험 관내 실험에서 수행의 두 가지 장점이 있습니다. 따라서, 이러한 두 가지 장점이 허용 한 연구진은 전체 유기체 외부 영향의 결과를 조절하는 능력에 이르는, 생체 내에서 특정한 유형의 세포의 행동을 예측한다. 그런 의미에서, 체외 세포 배양은 종종 기초 및 응용 생명 과학을 연결하는 다리로 작동합니다. 그럼에도 불구하고, 시험 관내에서 작동하는 여러 단점도 있는데, 가장 중요한 특정 예약 생리적으로 거하여되는 것을관찰 된 표현형의 알 관련성. 실제로, 하나의 세포 유형은 용기에서 배양하면, 배양은 다양한 범위까지 상실, 다른 세포 유형, 조직과 기원의 유기체 및 앵커 내에서 체액 환경에 기여와의 세포 간 연결 이를 활성화 조직 세포 기능에 중요한 때로 특정 입체 구조를 유지한다.

세포 간 관계의 문제가 혼합 된 배양 기술의 개발에 의해 해결되었다. 이 방법에서, 두 개 이상 세포 집단은 동일한 배양 용기에서 함께 성장시킨다. 그러나 이러한 혼합 문화는 중요한 불편을 부담. 한편, 일부 세포 아형 물리적 기원 조직으로 서로 상호 작용하지 않는 분비 가용성 인자 수용체 근처로 유지 분비 통신에만 의존. 이것은 근위 사이토 카인 신호에 따라 여러 가지 염증 과정의 경우입니다. 혼합 C에서ultures 물리적 상호 작용을 피할 수 있고 불가능 변경된 결과를 얻을 수있는 세포 – 세포 접촉의 부재 분비 통신 연구를 만든다. 한편, 혼합 집단 내에서 세포의 특정 해석을 달성하기 위해서는 상당히 결과에 미치는 영향을 거친 분리 기술의 사용없이 실행할 수 없게된다.

이러한 중요한 문제를 해결하기 위해, 조정 배지를 사용 실형 문화 분비 신호 전달 연구를 허용하는 기술이 개발되고있다. 이 방법은 세포의 다른 집단을 함유 한 웰 세포 유형, 따라서 에어컨 명명 된 배지 상등액의 전송을 요구한다. 그러나 중요한 단점은 단명 한 분자가 셀의 두번째 집단의 웰에 전송되는 조정 된 배지에서 충분히 생존하지 않는다는 것이다. 심지어 수명이 긴 분자는 크게 인해 확산에 시간이 지남에 희석됩니다. 또한, 두 세포인구는 단방향 통신 분비보다는 활성 쌍방향 통신에 참여한다. 이것은 그들이 체내에 존재하는 정확한 다세포 관계를 재현에서 중요한 피드백 신호의 부재로 이끈다.

결과적으로 더 나은 관내 셀룰러 환경에서의 생체 내 조건에서 일본어를 시뮬레이션 할 필요성에 의해 구동 세포 배양 기술의 여러 발전은 수년 동안 실현되어왔다. 가장 중요한 발전 중 하나는 1953 년 Grobstein 의해 처음 사용 된 세포 배양을 구획화를위한 미세 다공성 막과 투과성 지지체의 사용이었다 ^1. 이러한 투과성 지지체는 다수의 세포 유형을 수용하고 사용하기 년간 맞추어왔다 여러 가지 응용 프로그램입니다. 현재, 이러한 지원은 멀티 웰 조직 배양 접시에서 또는 새로운 Circu에 우물에서 휴식을 설계 속이 빈 삽입 존재LAR 요리. 공동 배양 시스템에서, 삽입이 잘 반면, 하나의 셀 유형을 포함하거나 요리는 체액 환경 (그림 1)에 세포의 서로 다른 두 집단의 기여를 연구 할 수 있도록, 다른 세포 인구를 포함한다. 그 결과, (혀끝의 분비 또는 신호 수신 대 기저) 세포 극성 따라서 혼합 문화와 에어컨 매체 기술을 통해 삽입 공동 문화 시스템에게 중요한 이점을 부여, 보존됩니다. 멤브레인 재료의 몇 가지 유형이 사용할 수있는 가장 일반적인 것 인 폴리 에스테르 (PET), 폴리 카보네이트 (PC) 또는 콜라겐 코팅 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)가 0.4 μm의 12.0 ㎛의 범위의 상이한 기공 크기에 존재. 재료 및 기공 크기의이 품종에 한정되지 사용하는 다음에 대해 서로 다른 수준에서 그들을 실용적 광학 특성, 막 두께 및 세포 부착과 관련된 변수 기능을 발휘 삽입의 스펙트럼을 제공합니다 :
-studying세포 분화, 배아 발달, 종양 전이 및 투과 막을 통해 chemotaxic 분석에 의해 상처 수리;
상피 또는 내피 단일 층을 통해 전송을 평가하여 약물의 침투를 -evaluating은 투과성 지원에 배양하고;
-performing 세포 공동 배양은 세포 – 세포 접촉이없는 수용성 분비 인자에 의해 유도 된 세포 변조 동작을 분석한다.

이 문서의 목적은 삽입 공 배양 시스템을 이용한 세포 – 세포 접촉이없는 분비 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가하는 상술 한 제 기능을 수행하기 위해 일반적인 방법론 지침을 설명하는 것이다. 연구의 여러 다른 필드는 세포 집단에서 분비 된 가용성 인자의 영향에 관련된 질문에 대답하기 위해 삽입 공 배양 시스템을 사용한다. 다양한 수준에서 세포 행동을 조절 실제로 분비 신호는 모든 조직에서 관련입니다및 삽입 공 배양 시스템을 만드는 시스템은이 분야의 발전을 위해 불가결. 반대로, 그 신호 전달을 확인할 수있는 인서트의 사용은 직접 세포 – 세포 접촉이 아닌 분비 요인이다. 인서트의 가장 중요한 용도 중 하나는 분비 된 사이토 카인의 효과는 다양한 면역 세포에서 평가되는 플레이어 염증 연구 ^2-14이다. 특히, 중추 신경계 (CNS) 염증의 연구는 더 크게 신경 염증 ^{15-21 구동} 뉴런 및 미세 아교 세포의 분비 독특한 역할을 정의 할 수있는 삽입 공 배양 과정에서 이익이있다. 이러한 시스템은 또한 감소 시키거나 염증성 인자 ^22-26의 분비를 억제하는 능력에 의존하여 분자의 항 염증 가능성을 연구하기 위해 고안되었다. 연구 메커니즘, 특히 암 ^27-31 관련된 혈관 ^32-34과 inflammati의 기초종양의 ^35-42에, 또한 삽입 공동 문화 시스템에서 도움이됩니다. 또한, 수용성 요소는 분화와 여러 연구가 특정 필드 ^43-50에서 질문에 답 삽입을 사용한 구동 과정에서 가장 중요하다. 중추 신경계에서 신경 조직으로 보는 것은 매우 제한된 갱신 전위 neurotrophism 연구를 가지며, 신경은 근본적인 널리 공존 배양 시스템 ^51-56 줄기 세포의 사용에 의해 확보되어왔다. 또한, 삽입은 신장 ^{57, 58,} 내피 상호 작용과 혈관 신생 ^59-62, 세포 사멸 비만과 대사 증후군 ^{22,23,66-67에 63 ~ 65,} 염증 신호, 내이 머리 세포 보호 등 다양한 분야에 활용된다 ^68,69, 심지어 곰팡이 독성 ^{(70, 71)} 및 기생충학 ^{72, 73입니다.}

이 문서에서는 experim을 설정하기 위해 일반적인 방법 론적 지침을 제공합니다삽입 공 배양 시스템을 사용하여 분비 된 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가보기 이비인후과. 특히, 우리는 신경 세포의 공동 문화와 신경 염증성 과정을 공부하고 자신의 용도에 우리의 관심을 초점을 맞출 것이다. 파일럿을 가능하게 삽입 실험의 매우 넓은 스펙트럼을 감안할 때,이 세포 배양 기술의 모든 측면을 다루 견딜 수있다. 예를 들어, 특정 프로토콜은 삽입 공 배양 방법의 구체적인 이해를 제공하는 상세하게 설명 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 분비되는 사이토 카인의 효과 PC12 신경 세포에 대한 N9의 미세 아교 세포를 부활 측정.

Protocol

NB는 : 포유류 세포 배양에 필요한 다음 각 단계를 층류 후드에서 멸균 조건 하에서 수행되어야한다. 또한, 최적의 무균 세포 배양에 대한 일반적인 가이드 라인, 적용 예., 팁 언제든지 그들이 교차 오염을 초래할 시각 세포의 양을 줄일 수있다 폐기 적절 전체 미디어 변경을 수행하지만 부드럽게 교반 할 때, 공기에 노출 될 세포 현탁액은 또한, 삽입 특수 처리가 필요 plasticware의 친절 등 자…

Representative Results

삽입 공 배양 시스템의 사용은 CNS의 다른 세포 분비 플레이어 사이의 관계를 보여주는 신경 염증성 과정의 연구에 특히 적절하다. 중추 신경계에서 면역은 휴식 분지의 상태 (그림 2A)에서 자신의 환경을 모니터링하고 감지 방해 할 수있는 미세 아교 세포라는 거주자 세포에 의해 주로 수행되는 수 문제가 적절한 신경 기능 76-78에 필요한 매우 귀중한 ?…

Discussion

모든 삽입 공동 문화 시스템 실험의 가장 중요한 단계는 실제로 사용하기에 적합한 인서트를 선택하는 거. 공극 크기 및 막 재료 시드 될 세포 형태 및 실험 목적을 고려 잊지 않고 철저한 고려되어야한다. 예를 들어, chemotaxic 분석은 세포 – 세포 접촉이없는 수용성 분비 인자에 의해 유도 된 세포 행동 변조를 분석하는 세포 공동 배양보다 공막의 동일한 유형을 사용할 수있다. 세포의 이동 및 세?…

Materials

RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum