الأمر الذي أدى إلى انسداد النسخ المتماثل الموقع المحدد في<i> E. القولونية</i> استخدام نظام نيون كاظمة المشغل
Summary
We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.
Abstract
العقبات موجودة على الحمض النووي، بما في ذلك البروتينات بإحكام والآفات المختلفة، يمكن أن تمنع بشدة تطور ماكينات النسخ المتماثل الخلية. وتوقف لجسيم مكرر يمكن أن يؤدي إلى التفكك لها من كروموسوم، سواء في جزء أو مجملها، مما أدى إلى انهيار شوكة النسخ المتماثل. الشفاء من هذا الانهيار هو ضرورة للخلية لبدقة كاملة ازدواج الكروموسومات وتقسيم وقت لاحق. آليات متنوعة لذلك، عند حدوث الانهيار، الخلية تطورت التي تجري لاستعادة شوكة الحمض النووي والسماح النسخ المتماثل إلى أن تكتمل مع الدقة العالية. سابقا، وقد تم دراسة هذه المسارات إصلاح تكرارها في البكتيريا باستخدام أضرار الأشعة فوق البنفسجية، والتي لديها عيب عدم المترجمة إلى موقع معروف. توضح هذه المخطوطة على نظام يستخدم نظام الإسفار كاظمة المشغل (FROS) لإنشاء كتلة البروتين في مواقع محددة يمكن أن تحفز المماطلة وانهيار تكرار FOركس في القولونية. البروتوكولات بالتفصيل كيفية وضع النسخ المتماثل يمكن تصور في الخلايا الحية واحدة باستخدام المجهر مضان وتكرار الحمض النووي وسيطة يمكن تحليلها من قبل 2-الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز. ويمكن إدراج درجة الحرارة المسوخ الحساسة من مكونات جسيم مكرر (على سبيل المثال DnaBts) في النظام للحث على انهيار متزامن من تكرار الشوك. وعلاوة على ذلك، فإن الأدوار من البروتينات إعادة التركيب وhelicases التي تشارك في هذه العمليات يمكن دراستها باستخدام بالضربة القاضية الجينية داخل هذا النظام.
Introduction
خلال تكرار الحمض النووي، وجسيم مكرر يواجه عقبات على الحمض النووي التي تعيق تقدمه. الحمض النووي من التلف بما في ذلك الآفات والثغرات فضلا عن الهياكل الشاذة يمكن أن تمنع جسيم مكرر من المضي 1. في الآونة الأخيرة، فقد وجد أن البروتينات منضمة إلى الحمض النووي هي المصدر الأكثر شيوعا للإعاقة على النسخ المتماثل تطور شوكة 2. معرفة الأحداث التي أعقبت لقاء للجسيم مكرر مع كتلة البروتين النووي قد سبق محدودة بسبب عدم القدرة على إحداث مثل كتلة في الكروموسوم من خلية حية في مكان معروف. في المختبر تحليل عززت فهمنا للسلوك الحركي من جسيم مكرر نشطة عندما تجتمع انسداد البروتين النووي 3، فضلا عن تفاصيل الآلية للجسيم مكرر نفسها 4،5. ويتم الاضطلاع الفهم الحالي للإصلاح النسخ المتماثل عادة مع الأشعة فوق البنفسجية وكيلا ضررا وتدرس باستخدام الحمض النووي البلازميد في الجسم الحي 6-8 </sتصل>. في حين أن البروتينات التي يمكن أن تشارك في إصلاح الحمض النووي بعد أنه واجه في الجسم الحي كتلة البروتين النووي مفهومة عموما من هذه الدراسات ما إذا كانت هناك اختلافات في الأحداث الجزيئية ضمن مسارات الإصلاح نظرا لسبب واضح في كتلة تكرارها لا يزال حتى الآن يحدد لاحقا.
هنا، نحن تصف النظام الذي يسمح للكتلة البروتين النووي التي ستنشأ في مكان معين من الكروموسوم باستخدام كاظمة نظام التشغيل نيون (FROS). علينا الاستفادة من سلالة من E. القولونية التي تمت زيارتها مجموعة من 240 مواقع تيتو دمجها في كروموسوم 9. كل موقع TETO ضمن مجموعة لديه 10 نقطة أساس تسلسل عشوائي المرافقة لزيادة استقرار مجموعة عن طريق منع إعادة التركيب بوساطة RECA داخل المصفوفة. هذه المجموعة، والاختلافات منه، واستخدمت أصلا لفهم E. القولونية ديناميات كروموسوم 10،11 ولكن تم بعد ذلك تكييفها لpreveالإقليم الشمالي في الجسم الحي تكرار 12. تم العثور على مجموعة إلى الحفاظ عليها بشكل مستقر ولمنع ما يقرب من 100٪ من الشوك النسخ المتماثل عند ملزمة TetR 10،12. وقد وجدت استخدام مجموعة LACO مماثلة في المختبر عدد قليل من كانت 22 موقعا كافية لمنع 90٪ من التكرار، على الرغم من أن هذه المجموعة أقصر كانت أقل فعالية في الجسم الحي 13. للتكيف مع مجموعة لإنشاء انسداد البروتين النووي، والبروتين كاظمة يجب أن يفرط إنتاجها للغاية في ظل الظروف الأمثل حيث أنه بعد ذلك بربط مجموعة لإنشاء حاجز. تشكيل انسداد، والإفراج لاحقا، يمكن رصدها من خلال استخدام المجهر مضان إذا تم استخدام البديل الموسومة fluorescently من قامع تيت. يشار إلى حالة تكرارها في كل خلية من قبل عدد من البؤر ينظر، حيث نقطة محورية واحدة تعني نسخة واحدة فقط من مجموعة موجودة داخل الخلية وبؤر متعددة تدل على تكرار النشط. هذا إعادة النشطةيتم تمكين الثني عندما يتم عكس انسداد البروتين النووي من خلال إضافة محفز مبرر له أن يقلل من تقارب ملزمة من TetR للموقع المشغل بما فيه الكفاية لجسيم مكرر على المضي قدما من خلال مجموعة. بروتين كاظمة لا يزال قادرا على ربط الحمض النووي مع قابلية عالية بما فيه الكفاية أن النسخ الآن متعددة من مجموعة يمكن تصور.
يمكن اكتشاف تفاصيل أكثر تعقيدا من الأحداث في انسداد البروتين النووي باستخدام محايد محايد ثنائي الأبعاد الاغاروز الكهربائي للهلام والتهجين الجنوبي 14-16. هذه التقنيات تسمح للتحليل الهياكل الحمض النووي عبر السكان. وسيطة النسخ التي يتم تشكيلها خلال هذا الحدث، وربما لا تزال دون اصلاح، يمكن تصور. من خلال تغيير انزيم التقييد وتحقيق الاستفادة منها، وسيطة يمكن تصور ليس فقط في المنطقة ولكن أيضا مجموعة من المنبع مجموعة عندما يرتد شوكة تكرار 17،18. الالانحدار يقام لاحقا إلى التفكك جسيم مكرر. فروع الوليدة الرائدة والمتخلفة منفصلة عن مسارات قالب ويصلب لبعضها البعض كما فروع قالب بالتزامن إعادة يصلب، مما أدى إلى بنية الحمض النووي رباعية (أ تقاطع هوليداي).
باستخدام هذا النظام فقد تبين أن شوكة تكرار غير مستقر عندما يواجه هذه الكتلة 18. وبالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحرارة المشتقات الحساسة من مكونات جسيم مكرر يمكن استخدامها لمنع إعادة الشوكة تكرارها بعد أن يكون قد انهارت. مرة واحدة يتم تأسيس كتلة، سلالة يمكن تحويل إلى درجة حرارة غير متساهلة لضمان التعطيل متزامن من جسيم مكرر والوقاية التي تتحكم فيها من إعادة شحن. هذا التعطيل الناجم عن الحرارة يضمن كل من الشوك في أوساط السكان قد انهار في وقت معين، ويسمح تقييم ما يحدث عندما ينهار جسيم مكرر، وكيف يتم معالجة الحمض النووي، وما هو المطلوب لإعادةبدء عملية تكرار الحمض النووي.
ميزة من النظام المذكور هنا هو أن كتلة البروتين النووي هو عكسها تماما. وبالتالي فإن قدرة الخلايا على التعافي من كتلة البروتين النووي هي قادرة على أن يتبع. وإضافة إلى anhydrotetracycline الخلايا تخفيف الربط ضيق من كاظمة، والسماح لشوكة النسخ المتماثل إلى المضي قدما من خلال والخلية لاستعادة قدرتها على البقاء. تخفيف من انسداد يمكن تصور بواسطة محايد محايد ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز بعد 5 دقائق، وبواسطة المجهر في غضون 10 دقيقة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل الجدوى تكشف عن قدرة سلالة للتعافي من انسداد التكرار والاستمرار لتتكاثر.
عن طريق تغيير الخلفية الوراثية للسلالات المستخدمة في إجراء التجارب وصفها هنا، مسارات إصلاح لهذا النوع من انسداد يمكن إجمال.
Protocol
Representative Results
Discussion
During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].
Materials
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
| Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
| Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
| eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
| CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
| MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
| Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
| TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
| Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
| Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
| Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
| Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
| UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
| Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
| Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
| Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
| 3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
| Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
| Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
| Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
| Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
| dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
| Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
| Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
| Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 x 300mm |
Referencias
- Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
- Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).
- Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).
- Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).
- Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).
- Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).
- Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).
- Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).
- Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).
- Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).
- Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
- Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).
- Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).
- Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).
- Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).
- Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).
- Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).
- Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).
