Abstract
適応だけでなく、内皮表現型と遺伝子発現の病理学的変化を誘導することにより、血管生理学および病態生理学における血管の流体せん断重要な役割を果たしての正常レベルとパターンからの逸脱。具体的には、定期的に、一方向の流動誘起剪断応力の不適応な効果は、いくつかの血管の細胞型、特に内皮細胞上のさまざまな効果を引き起こすことができます。今では、多様な解剖学的起源から内皮細胞が培養されているが、中・深さは、流体のせん断に対する反応の解析せん断モデル( 例えば、平行平板フローチャンバー、コーン・プレート・フロー・モデル)の相対的な複雑さによって妨げられてきました。これらのすべては優れたアプローチを示しているが、このようなモデルは、ボットへの挑戦を作成し、技術的に複雑であり、比較的長く、複雑なセットアップ時間、低表面積、多くの場合、シーラントおよびガスケットを必要とするポンプと加圧用の要件などの欠点があります時間無菌性の維持及び複数の実験を実行することができません。しかし、流れ及びせん断のより高いスループットモデルが利用可能であった場合は、血管内皮せん断応答、分子レベルで、特に定期的なせん断研究に大きな進展、より急速に進んだことがあります。簡単に単方向、周期的なせん断応力試験で実験的な反復の数が多いを可能にする比較的大きな表面積を持つ、簡単に組み立て小説、かつ安価な組織培養モデル:ここでは、せん断リングの構造や使用方法を説明します内皮細胞。
Introduction
シス調節エレメント6の活性化、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性7と剪断応力応答エレメント(SSRE)8を介して5 -流体せん断応力は、内皮遺伝子プログラム1を調節することが示されています。組織因子9及び組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)10発現を調節することによって、応力の影響を凝固向かっ内皮寄与せん断。せん断応力もPDGF-Bの合成と応答8を制御することにより、血管新生11と血管リモデリングの制御に影響を与えます。内皮由来の血管作動性メディエーターのアドレノメデュリン、エンドセリン-1、ウロテンシンIIおよびリラキシンはまた、せん断12によって規制されています。内皮型一酸化窒素合成酵素の産生および一酸化窒素産生の転写は、両方のせん断依存10です。せん断はまた、内皮ICAM-1の発現13を制御します。したがってpowerfuでき流れによって誘発されるせん断応力LLY内皮応答の多種多様な影響を与えます。重要なことには、血管の脈動は、現在、正常な血管の老化および血管性認知症14の形態の両方の病態生理に重要な役割を果たしているように見え、さらに、多発性硬化症15のような他の神経変性疾患に寄与し得ます。
静脈および動脈の内皮細胞は、本質的に、生体内で多様な血行力学的流動パターンに曝される、多くの異なる内皮細胞表現型は、16を発揮することができます。流れの大きさと周期性に依存して、内皮細胞への影響は、遺伝子またはタンパク質発現17,18の変化を反映することができる、炎症性細胞の活性化およびアポトーシスを含むことができます。現象を剪断する内皮細胞応答の研究は、したがって、十分にそのような剪断パターンを生成するインビトロモデルにおける生産の難しさによって複雑に残ります。
多くの異なるexperimeNTALプロトコルは、細胞単層の内皮細胞に流体せん断応力を適用するために開発されています。 21 -最も一般的に使用されるシステムの一つは、チャンバ19内に均一な層流を生成する平行プレートフローチャンバーです。蠕動ポンプは、典型的には、典型的には、インビボ 22 内の多くの場所に流れ特性を再現することができる周期的な流れを作成するために接続されています。他の一般的なセットアップは、流体せん断応力は、コーン23の回転速度によって決定されます。「コーン・プレート」モデルを使用しています。どちらのシステムも、それらに類似する他の構成は、セットアップし、多くの研究室には比較的高価で、アクセスできなくすることができるコンポーネントを必要とする退屈することができます。
これらの現在のモデルのもう一つの主要な制限は、同時に、比較的低い表面積を有する、それぞれ行うことができる反復試験の比較的少数です。これは、時間と共増加しますこのようなアプローチのmplexity。したがって、単方向および定期的なせん断を誘導する理想的なモデルは、比較的大きな表面積を持つ研究の複製の数が多いが簡単に設定することができます1、それぞれのかもしれません。また、上記のモデルは、多くのユーザーのためにコスト高であってもよい、かなり洗練されたセットアップが必要です。基本的な実験用材料を用いた流体せん断障害を生成することができますモデルは、いくつかの利点があるかもしれません。
単方向、定期的なせん断応力を印加したシンプルかつ非常に経済的な方法は、オービタルシェーカー24上に円形の皿を配置することを含みます。必要に応じて、このプロトコルは、非常に単純であり、研究の反復の高い数字を達成するためにスケールアップすることができ、比較的大きな表面積を持つ各。しかし、皿の中央に位置するセルは、同じ皿の中の混合の細胞表現型の応答を得、周囲に沿って細胞とは異なる流れのパターンにさらされています。
_content ">この現在のレポートでは、「せん断リング」、単方向および定期的なせん断応力を作成するための我々のモデルの構築および使用について説明します。デザインをせん断リングのために効果的に制限「混合」携帯せん断誘発性表現型をフローを制限することにより、内輪の配置を介して周囲に円形の培養皿内経路せん断リングの構成及び動作は簡単で経済的であり、容易に広く利用可能な組織培養用品を使用してオービタルシェーカーの広い範囲に対応するようにスケーリングすることができる。このモデルは、生理学的および病態生理学的なレベル内に一方向と周期的流れパターンを提供するために、内皮細胞実験に適用することができます。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 150ミリメートル直径せん断リングの構築(図1)
注:せん断リングは、異なる総表面積を有するデバイスが得られ、外側及び内側のペトリ皿の大きさを変えることにより、多くの異なる寸法を作成するために構成された細胞収量および剪断力の範囲を開発することができます。このレポートでは、98センチメートル2( 図2)の総表面積のための内部100ミリメートル皿と組み合わせた150ミリメートル皿を説明します。
図1.せん断リングアセンブリ。図の上の部分は、部分的に組み立てられたせん断リングを示しています。気密シールが完全に内側と外側の皿との間に形成されていない場合、転送ピペットで3mmの穴を介して塩化メチレンを0.5mlを注入。せん断リングは、内側EDGの周りにシリコーンゴム接着剤の厚さ1mmのビーズを適用することによって遮断シールされていますせん断リングトップの電子。図の下の部分は、組み立てられたせん断リングを示しています。青色メッキ内皮細胞の領域を表します。外側と内側の赤い矢印は、オービタルシェーカー上に配置されたせん断リングの内側せん断リングとメディアの軌道運動を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図150ミリメートルせん断リングのため2.表面の測定(スケールで描かれていない)。トップパネルは軌道回転に応じて、外側のリングに向かって流体の遠心移動を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 生成することにより、せん断リング建設テンプレートを作成します。150ミリメートルの円の中心に配置された100ミリメートル、内径とプレゼンテーションソフトウェアで150ミリメートル外側のエッジプロファイル。 A4白い紙にテンプレートを印刷します。
- ピペットの150mmガラスペトリ皿に塩化メチレン(ジクロロメタン)を10ml。塩化メチレンが、ほとんどのプラスチックを可溶化し、プラスチック部品を結合するために、ここで使用される料理は、ガラスではなく、ポリスチレン(または他のビニルプラスチック)であることが重要です。
注意:適切なフードの換気をすべての建設のために手袋を使用してください。メチレンクロライドは、接触刺激性であり、肝毒性です。 - 外側せん断リングテンプレート上に150ミリメートルのプラスチックペトリ皿を合わせます。
- 回転工具を用いて100 mmディッシュの中央に3mmの穴を開けます。掘削から生成される任意のプラスチックの削りくずを取り除きます。
- 手袋をはめた手で押さえながら、反転し、約3秒間塩化メチレンのプールに前のステップから100ミリメートルペトリ皿の上縁を浸します。
- トランス慎重にマークされたテンプレート上に100ミリメートル皿を合わせて、150ミリメートル皿の中央に100ミリメートルディッシュエッジダウンを「濡れる」をFER。塩化メチレンは、100ミリメートルと150ミリメートル皿に参加し、プラスチックを融合します。ゆっくり100ミリメートル皿を時計回りに回転させ、数回反時計回りに150ミリメートル皿に良好な接着性を確保するために。
注:外皿の中央に内側の皿の適切な位置合わせを確実にするために、十分に注意してください。偏心位置合わせは、剪断環の異なる位置でせん断応力の変動をもたらすことができます。塩化メチレンが誤って100ミリメートル皿の配置中に150ミリメートルペトリ皿の外側のトラック部分の上に滴下することができないように注意してください。これは、流れの乱れを引き起こす可能性がある不均一な表面を作成する、細胞が成長する底面にプラスチックを溶融します。 - 塩化メチレンを乾燥させた後、オーバー新たにバインドされたペトリ皿を反転し、慎重にそれを確実にするための接点を検査気密シールは、二つのペトリ皿との間に形成されています。
- 気密シールが完全に形成されていない場合、転送ピペットで3mmの穴を介して塩化メチレンを0.5mlを注入。料理をピックアップし、静かに塩化メチレンがエッジに到達できるようにするには、それを回転させます。
注:あまりにも速く回転させた場合、塩化メチレンは、細胞が成長する表面を変形とせん断リングを台無しに、150ミリメートル皿の外側部分に波及することができます。漏れたせん断リングは捨ててください。 - シリコンゴムシーラントの3mmのビーズを適用することにより、100mMの皿穴を密封。
- フラットカッティングヘッドを取り付けた回転工具を使用して、キャップ下のチューブの少なくとも1cmに残し、15ミリリットルの円錐ポリスチレン組織培養管のトップ3のCM部分をカット。滑らかで平坦な切断ヘッドの平らな面を使用してまで、カットチューブの端を磨きます。粉砕することにより生成される任意のプラスチックの削りくずを取り除きます。
- 上にカットオフ15ミリリットルにコニカルチューブをトレース約0.5センチメートル離れた皿のエッジからマーカー、と150ミリメートル皿の蓋。円の端からのマージン約1〜2ミリメートル残して、描かれた円の内側の穴を開けます。
- ドリル穴の上にカットオフコニカルチューブトップを置きます。転送ピペットを用いて、150ミリメートルの蓋にコニカルチューブを結合するために円錐管のカットオフエッジに塩化メチレンの約250μLを適用します。
- トップペトリ皿の内側の縁の周りにシリコンゴムシーラントの厚さ1mmのビーズを適用することにより、150ミリメートル皿に150ミリメートルのふたを封印。
せん断リングの2滅菌
- 15ミリリットルコニカルチューブポートを介して新たに形成されたせん断リングにリン酸緩衝生理食塩水のピペットで約10ミリリットル。せん断リングの内側に任意の破片を除去するために周りに渦巻きます。パスツールピペット/真空アスピレーターでリン酸緩衝生理食塩水を削除してください。
- 破片が除去されるまで、前の手順を繰り返します。
- steriへせん断リング平安大町、UV照射を用いて70%エタノール洗浄を組み合わせて使用します。
- アクセスポートを介して通気キャップ、ピペット70%エタノールの約10ミリリットルを外し、バックのキャップをねじ込みます。せん断リングの内側を十分に洗浄することを確認して、複数回回転させ、せん断リング裏返し。
- ヒュームフードの下では、過剰70%エタノールを吸引除去します。スプレーボトルを用いて、完全に70%エタノールでキャップし、アクセスポートをスプレー。
- 完全に乾燥するまで組織培養フード内にUV照射下でせん断リングとキャップを置きます。
- 細胞培養めっきに使用するまで乾燥すると、室温でのバックキャップと店舗滅菌せん断リングをねじ込みます。
3.せん断応力の研究
- 形質転換された内皮細胞株のための4分割比:典型的には1を使用して、標準的な細胞培養プロトコルに従って滅菌剪断環中の内皮細胞をプレート。
注:ラットの網膜microvascular内皮細胞は、市販のものを入手しました。人間の脳内皮細胞(hCMEC / D3)細胞は博士ピエール・オリバークーロ(INSERM、フランス)からの寛大な贈り物として提供され、完全な内皮基礎培地(EBM)中で培養しました。 - 文化は前流研究の開始に合流に到達することを可能にします。組織培養培地を30ml(10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシン有するダルベッコ改変イーグル培地)を使用します。 3日おきに細胞培養培地を変更し、7.5%CO 2および92.5%の室内空気で、37℃で細胞を維持します。
- インキュベーター中でオービタルシェーカーを置きます。
注:オービタルシェーカーは、一般的に重いです(> 10キロ)。棚ストレスや振動を最小限に抑えるために、インキュベーターの底棚にオービタルシェーカーを置きます。 - オービタルシェーカー上で実験的なせん断リングを配置します。同じインキュベータ内部の静的コントロール群せん断リングを配置します。
- SH内の最大せん断応力を推定式耳リングどこ (単位cm)オービタルシェーカーのために回転半径は、 媒体の粘度(ポアズで)であります (グラム/ミリリットルで)媒体の密度であり、かつ 24(回転/秒)の回転周波数です。
- せん断応力印加( 例えば 、72時間)の所望の期間のためにシェーカー上でせん断リングを残して、希望の回転数( 例えば、90回転)にオービタルシェーカー上で回転設定を開始します。
注:オービタルシェーカーは、熱を生成することができますので、インキュベーターの温度は37°Cを実験期間を通して維持されることを保証するために、最初に監視する必要があります。また、Sリングは、環境室( 例えば 、モジュラーインキュベーターチャンバー)に移し、その後、回転培養器内に配置することができます聞いています。 - 細胞層は、所望の時間に対するせん断インキュベーターから剪断リングを除去するために露出された後。せん断リングふたをやってのけるし、所望の終点分析( 例えば、ウエスタンブロット法、蛍光活性化セルソーティングなど )25を調べるため、細胞および/またはメディアを取り出します。
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Representative Results
ここでは、せん断リングで培養hCMEC / D3脳内皮細胞およびラット網膜微小血管内皮細胞単層、両方からの代表的な結果を提示します。
hCMEC / D3脳内皮細胞単層を完全EBMでコンフルエンスまで成長させた後、剪断リング72時間オービタルシェーカー上に置きました。ステップ3.5から式を用いて、計算された最大せん断応力たパラメータを持つ約2.8ダイン/ cm 2の( = 0.95センチメートル、 = 0.0101ポイズ、 = 0.9973グラム/ミリリットル24、 = 1.5回転/秒 )。我々は、細胞層は、通常、試験を通してせん断リング表面への優れた接着性を有するので、これは均一に観察されないが、これらの内皮細胞単層は、時々 、周期的な流れ( 図3)の方向に平行に位置合わせを示すことを見出しました。
ラット網膜微小血管内皮細胞単層がEGF / VEGF成長因子サプリメントを含む完全なラット内皮細胞培地でコンフルエントになるまで成長させた後、剪断リング72時間オービタルシェーカー上に置きました。ステップ3.5から式を用いて、計算された最大せん断応力パラメータを持つ約12ダイン/ cm 2でした( = 0.95センチメートル、 = 0.0101ポイズ、ジル/ ftp_upload / 54632 / 54632eq4.jpg "/> = 0.9973グラム/ミリリットル24、 =第4回転/)。 図4は、βアクチンをローディング対照と比較して、内皮細胞表面からの血小板内皮細胞接着分子(PECAM-1 / CD31)の大きく、かなりの損失があったことを示しています。
PECAM-1は、免疫受容体チロシン依存的な阻害モチーフまたは「ITIM」26が含まれてい-superfamily免疫グロブリン(Ig)のメンバーである内在性膜タンパク質です。 PECAM-1内皮細胞上で発現されるだけでなく、造血細胞上に見出されます。 PECAM-1は、剪断応力のメカノトランスダクション、重要な内皮細胞 - 細胞接着、白血球の接合部の遊出、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たし、そして。せん断応力を感知におけるPECAM-1の役割は、血管endotheliの機能にとって重要ですアル細胞およびホメオスタシス17。内皮単層をせん断応力に曝露されたとき、PECAM-1は、チロシンリン酸化を変化させることにより、その上に及ぼされる機械的な力、カスケード27シグナル ERK1 / 2のその後の活性化に直接応答します。さらに、PECAM-1-eNOSの複雑な関連付けは、せん断応力28の障害によって中断されています。したがって、PECAM-1は、血管壁29の反応性拡張につながることができ、流体せん断応力力の変化を感知するために血管内皮細胞を可能にします。
これらのデータは、内皮細胞が細胞間接触だけでなく、経血管細胞の交換を仲介ダウンレギュレーションの重要な接合と接着決定要因によって定期的に、一方向流体せん断への暴露に応答することを示す。このモデルをサポートしています。
632fig3.jpg "/>
せん断リング図 3. 脳内皮細胞の形態。定期的な流体せん断または静止露光の48時間後にせん断リングでhCMEC / D3endothelial細胞単層の外観。文化のアライメントは常に。(矢印で示す)の方向に流れるように平行に観察されない。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
定期的なせん断に 図4. 細胞応答。せん断リングで培養したラット網膜微小血管内皮細胞単層 PECAM1 / CD31の相対の減少は、βアクチンが示された周期的な流体シアの72時間後に、(各n = 3、学生対応のないt検定を、* -p <0.05、エラーバーは標準偏差を参照してください)せん断リングでrを。
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Discussion
剪断する内皮細胞を露出させるためのせん断環系の構築には、せん断応力の試験を実行する簡単な方法です。それにもかかわらず、優れたせん断リングとより良い結果を得るために重要であるいくつかのステップがあります。完全なシールは、サンプル間で矛盾したせん断応力を作成することができ漏れからメディアを防止するために、内側と外側のリングとの間になされるべきです。完全なシールがなされていない場合は、塩化メチレンの最小量は、内側リングの穴から転送ピペットで内側と外側の皿間のエッジに追加されるべきです。穏やかに塩化メチレンを完全にシールを形成するために可能にすべきであるリングを回転させます。また、不用意に切断から生成されたプラスチック製の削りくずは、せん断リング軌道上に存在することができるので、悪影響細胞の成長に影響を与えると矛盾せん断応力アプリケーションを与えることができる任意の破片を除去しなければならない建設後のせん断リングを洗い流し。
の資料に記載聞くリングは、サンプル当たりの出力の大量につながる、サイズが比較的大きいです。しかしながら、より小さなバージョンは、より小さなペトリ皿を用いて構成することができる( 例えば 60ミリ挿入では、100mmペトリ皿)。複数の小さなせん断リングを構築することは、研究の高い数値を可能にすることができ、他の方法と比較すると、まだサンプルあたりの比較的大きな流体体積と表面積を維持したまま複製します。
せん断リングを使用する場合、いくつかの問題が指摘されています。まず、いくつかのオービタルシェーカーは、熱の過剰量を生成し、いくつかのインキュベーターは、温度の増加を制御することができません。これは、回転子の適切な選択、はるかに容易に熱交換を非水ジャケットインキュベーター、を使用することによって回避することができます。特にオープンエアの環境で、アセンブリ以下、せん断リングを使用するときに培養汚染は別の潜在的な関心事です。せん断リングは使用前に完全に滅菌されなければなりません。
などを調整することができるはずです)所望の周期的な、一方向の剪断応力を生成します。
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Disclosures
J. Winnyのユンはアネット・ファニセロ財団から研究助成金を持っています。 J.スティーブンアレクサンダーは、神経内科、LSUHSC-Sからの研究をサポートしています。
Acknowledgments
著者は、氏クリストファー・グエン、アーロン・ハンターとシュリーブポートジャンプスタート、SMART、およびBiostartのトレーニングプログラムの支援だけでなく、生物物理学、シュリーブポート、LAのセンテナリー大学ルイジアナ州の部門に感謝したいです。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
150 mm glass Petri dish | Fisher | 3160150BO | |
15 ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
ethanol | Decon | 2701 | |
3 ml transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
printer paper | |||
scissors | |||
gloves | |||
rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
rotary tool drill head | |||
distilled water | |||
orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
incubator | |||
Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
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