Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones
Summary
The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.
Abstract
Patienten mit einer begrenzten Anzahl von Lebermetastasen und langsam Progressionsraten können erfolgreich mit lokalen Behandlungsansätze 1,2 behandelt werden. Es ist jedoch wenig über die Heterogenität der Lebermetastasen bekannt und Tiermodellen der Lage, die Entwicklung individueller metastatischen Kolonien Auswertung benötigt. Hier präsentieren wir eine erweiterte Modell von Lebermetastasen, die die Fähigkeit bietet, um quantitativ die Entwicklung individueller Tumor Klone in der Leber zu visualisieren und deren Wachstumskinetik und Kolonisierung Effizienz abzuschätzen. Wir erzeugten eine Reihe von monoklonalen Derivate von HCT116 menschlichen Zellen Darmkrebs stabil markiert mit Luciferase und tdTomato und unterschiedliche Wachstumseigenschaften besitzen. Mit einer splenic Injektion durch eine Splenektomie gefolgt sind die meisten dieser Klone können Lebermetastasen zu erzeugen, aber mit unterschiedlichen Frequenzen der Kolonisierung und unterschiedlichen Wachstumsraten. Unter Verwendung der In Vivo Imaging System (IVIS) ist es möglich , die Entwicklung mit Metastasierung in vivo lumineszente und ex vivo Fluoreszenzabbildung sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Zusätzlich stellt Diffuse Leucht Imaging Tomography (DLIT) eine 3D – Verteilung von Lebermetastasen in vivo. Ex – vivo – Fluoreszenz – Bildgebung des geernteten Lebern quantitative Messungen einzelner hepatischen metastatischen Kolonien liefert, so dass für die Auswertung der Häufigkeit der Leber Kolonisierung und die Wachstumskinetik von Metastasen. Da das Modell zu klinisch beobachtet Lebermetastasen ähnlich ist, kann es als eine Modalität dienen Genen assoziiert mit Lebermetastasierung und zur Prüfung Potential ablative oder adjuvanten Behandlung von Leber-Metastasen nachzuweisen.
Introduction
Patienten mit Lebermetastasen von primären Darmkrebs (CRC) durch eine schlechte Prognose gekennzeichnet. Die 5-Jahres – Überlebensrate für die primäre nonmetastatic CRC (Phasen I – III) – 88% 3,4, während Patienten mit Lebermetastasen (Stadium IV) haben eine 5-Jahres – Überlebensrate von nur 8 – als 75 auf 12% geschätzt 5 , 6. Patienten mit metastasiertem stellen jedoch eine heterogene Gruppe, mit einer unterschiedlichen Anzahl von Metastasen und verschiedenen Wiederholungszeiten präsentiert. Klinische Beobachtungen zeigen , dass die Anzahl der Metastasen (die Fähigkeit zur Besiedelung oder Häufigkeit der Kolonisierung proportional sein kann) und die Größe einer einzelnen Metastasierung (proportional zum lokalen Wachstumsrate) sind unabhängige prognostische Faktoren 1,7. Mit anderen Worten hängt der Erfolg von metastasierendem Klone die Leber Kolonisierung auf zwei Haupteigenschaften: ihre Fähigkeit, in der Leber-Mikroumgebung zu wachsen und ihre Fähigkeit, zu verbreiten und zu überleben.
Das Designvon erfolgreichen klinischen Modelle mit der Fähigkeit zur Erfassung und die Eigenschaften von metastasierendem Klone Quantifizierung drastisch unser Verständnis von Lebermetastasen Biologie und bieten ein effektives Werkzeug für die Gestaltung von potentiellen therapeutischen Ansätze zu verbessern. Modellen experimenteller Lebermetastasen wurden 8,9 bereits berichtet, aber keiner von ihnen die Fähigkeit bereitgestellt Eigenschaften einzelner Klone metastatic quantitativ zu erfassen und zu beschreiben , sowohl in vivo als auch ex vivo.
Hier präsentieren wir eine neue, erweiterte Modell von Lebermetastasen, die die Erzeugung von Tumor-Klone mit verschiedenen Leber Kolonisation Effizienzen und Wachstumseigenschaften umfasst. Wir verwendeten eine Kombination von Doppel-Markierung von Krebszellen mit Luciferase und tdTomato fluoreszierendes Protein mit der Erzeugung von monoklonalen Zelllinien, die intrinsische Unterschiede in metastatischen Kapazität. In diesem experimentellen Modell zeigen die Daten, dass die Entwicklung vonLebermetastasen kann in Bezug auf die Frequenz und Kolonisierung Verdopplungszeit (Td) beschrieben, die mit klinischen Beobachtungen konsistent ist. Die quantitative Natur dieses Modells macht es für die Wirkstoffforschung und diagnostische Zwecke leicht einnehmbaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Tiermodell im aktuellen Bericht dargestellt basiert auf zwei Hauptansätze. Erstens, um die Fähigkeit zu beobachten metastatic Klone mit unterschiedlichen Neigungen zu gewährleisten zu kolonisieren und in der Leber, eine Gruppe von sehr heterogenen monoklonalen Zelllinien wurde festgestellt, anstatt einer etablierten unfraktioniertem Krebszelllinie 12,13 vermehren. Der monoklonale Ansatz Entwicklung zur Metastasierung wird durch die jüngsten genomischen Daten 14 gerechtfertigt und wurde erfo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Geoffrey L. Greene (University of Chicago) für das Luc2-tdTomato Plasmid und der HCT116-Zelllinie, Herr Ani Solanki (Tier Resource Center) für die Mäuse-Management, und Dr. Lara Leoni für die Unterstützung danken, mit dem DLIT. Quantifizierungen von fluoreszierenden und lumineszenten Intensitäten wurden im Integrierten Kleintier Imaging Research Ressourcen an der Universität von Chicago auf einem IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA) durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Virginia und DK Ludwig Fonds für Krebsforschung unterstützt wurde, die Lung Cancer Research Foundation (LCRF), die Prostate Cancer Foundation (PCF) und die Cancer Center Support Grant (P30CA014599). Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen.
Materials
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
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