Инструменты для изучения роли архитектурного белка HMGB1 в обработке Helix искажающие, Сайт-специфическая ДНК Interstrand сшивок
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
Группа коробки Высокая мобильность 1 (HMGB1) белок представляет собой негистоновых архитектурный белок, который участвует в регуляции многих важных функций в геноме, такие как транскрипции, репликации ДНК и репарации ДНК. HMGB1 связывается с структурно искаженный ДНК с более высоким сродством, чем к каноническому B-ДНК. Например, мы обнаружили, что HMGB1 связывается с ДНК interstrand сшивок (МКСТ), которые ковалентно связывают две нити ДНК, вызывают искажение спирали, и если оставить неотремонтированный может привести к гибели клеток. Из-за их цитотоксическое, несколько ICL индуцирующие агенты в настоящее время используются в качестве химиотерапевтических агентов в клинике. В то время как ICL-агенты , формирующие показывают предпочтения для определенных последовательностей оснований (например, 5'-TA-3 'является предпочтительным местом для сшивания псорален), они в значительной степени вызывают повреждение ДНК в неизбирательным образом. Тем не менее, путем ковалентного связывания ИКЛ-индуцирующего агента к триплекс-образующих олигонуклеотидов (ФБПС), который связывается с ДНК в последовательности конкретныхСпособ, целевое повреждение ДНК может быть достигнута. Здесь мы используем TFO ковалентно конъюгированный с 'концом к 4'-гидроксиметил-4,5' в 5, 8-trimethylpsoralen (ГМТ) псорален, чтобы создать сайт-специфическую ICL на мутацию репортерной плазмидой, чтобы использовать в качестве инструмента изучить архитектурные изменения, обработки и ремонта сложных повреждений ДНК с помощью HMGB1 в клетках человека. Описаны экспериментальные методы для подготовки ФБПС-направленных ICLS на репортер плазмид, и допросить ассоциацию HMGB1 с ФБПС направленными ICL, в сотовой связи с использованием хроматин иммунопреципитации. Кроме того, мы опишем суперспирализацию анализы ДНК, чтобы оценить конкретную архитектурную модификацию поврежденной ДНК путем измерения количества оборотов сверхвитков введенных на псоралена-сшитый плазмиды HMGB1. Эти методы могут быть использованы для изучения роли других белков, участвующих в обработке и ремонту ТФО-направленных ICL, или других повреждений целевой ДНК в любой клеточной линии, представляющей интерес.
Introduction
Триплекс-образующих олигонуклеотидов (TFOs) связывают дуплекса ДНК в моде последовательности конкретных посредством связывания Хугстена-водорода с образованием тройной спиральные структуры 1-5. Триплекс технология была использована , чтобы допросить ряд биомолекулярных механизмов, таких как транскрипции, репарации повреждений ДНК и генного таргетинга (обзор в ссылках 6-8). TFOs широко используются для индукции сайт-специфического повреждения репортерных плазмид 9,10. Наша лаборатория и другие ранее использовали ФБПС, AG30, привязанный к псоралена молекулы индуцировать сайт-специфических ДНК interstrand сшивок (МКСТ) в гене supF на плазмиды pSupFG1 5,10-12. ICLS весьма цитотоксическое , как эти поражения ковалентного две нити ДНК, и , если оставить неотремонтированный, может блокировать транскрипцию генов и препятствовать механизм репликации ДНК 13,14. Из-за их цитотоксическое, ICL-индуцирующие агенты были использованы в качестве химиотерапевтических препаратов при лечениирака и других заболеваний 15. Тем не менее, обработка и ремонт ICL, в клетках человека не очень хорошо понял. Таким образом, более глубокое понимание механизмов, участвующих в обработке ICL, в клетках человека может помочь улучшить эффективность ICL на основе химиотерапевтических препаратов. ФБПС-индуцированные ICLS и их промежуточные ремонт имеют потенциал, чтобы вызвать значительные структурные искажения в спирали ДНК. Такие искажения являются вероятные цели для архитектурных белков, которые связываются с искаженной ДНК с более высоким сродством , чем к канонической В-форме дуплексной ДНК 16-20. Здесь мы изучали ассоциацию весьма обильной архитектурного белка, HMGB1 с ICL, в клетках человека с помощью иммунопреципитации хроматина (CHIP) анализов на псорален-сшитый плазмид и определили роль HMGB1 в модуляции топологии псоралена-сшитой ДНК плазмиды в человека раковых клеток лизатов.
HMGB1 является весьма обильны и повсеместно экспрессируется без еготон архитектурный белок , который связывается с поврежденной ДНК и альтернативно структурированных субстратов ДНК с более высоким сродством , чем каноническая В-формы ДНК 17-20. HMGB1 участвует в нескольких процессах ДНК метаболизма, таких как транскрипции, репликации ДНК и репарации ДНК 16,21-23. Ранее мы показали , что HMGB1 связывается с ТФО направленными ICL , в пробирке с высоким сродством 20. Кроме того, мы показали , что отсутствие HMGB1 увеличил мутагенный обработку ФБПС-направленных ICL , и определил HMGB1 как ремонт нуклеотид иссечения (РЭК) кофактора 23,24. В последнее время , мы обнаружили , что HMGB1 связан с ТФО направленными ICL , в клетках человека и его набор таких поражений зависит от белка Нирова РФА 16. Отрицательный сверхспирализация ДНК было показано , способствовать эффективному удалению повреждений ДНК с помощью НЭК 25, и мы обнаружили , что HMGB1 вызывает отрицательную суперспирализацию преимущественно на ФБПС-направленных ICL-содержащих пласередине подложки (относительно неповрежденных плазмид субстратов) 16, обеспечивая лучшее понимание потенциальной роли (ами) HMGB1 как NER кофактора. Обработка ICL, до конца не изучен в клетках человека; Таким образом, методы и анализы, разработанные на основе молекулярных инструментов, описанных здесь, может привести к идентификации дополнительных белков, участвующих в ICL ремонта, которые в свою очередь могут служить фармакологические мишени, которые могут быть использованы для повышения эффективности химиотерапии рака.
Здесь, эффективный подход к оценке эффективности ТФО-направленного формирования ICL в плазмидной ДНК с помощью денатурирующего электрофореза в агарозном геле обсуждалось. Кроме того, с помощью плазмид, содержащих ТФО направленный ICLS, методы для определения ассоциации HMGB1 с ICL-поврежденных плазмид в клеточном контексте с использованием модифицированных анализов щепу были описаны. Кроме того, легкий способ для изучения топологических изменений, вносимых гое архитектурный белок HMGB1, в частности, на ICL поврежденных плазмидных субстратов в лизатах клеток человека были определены путем выполнения суперспирализацию анализов с помощью двумерного электрофореза в агарозном геле. Методики, описанные могут быть использованы для дальнейшего понимания участия репарации ДНК и архитектурных белков в обработке целевых повреждений ДНК на плазмид в клетках человека.
Опишем подробные протоколы для формирования ТФО сайт-специфические псорален ICL, на плазмидной ДНК, и последующей плазмиды жечных и суперспирализацию анализы для идентификации белков, которые ассоциированы с повреждениями, а также белки, которые изменяют топологию ДНК, соответственно. Эти анализы могут быть модифицированы, чтобы выполнить с другими ДНК-повреждающих агентов, TFOs, плазмидной субстратов и млекопитающих клеточных линий, представляющих интерес. На самом деле, мы показали , что существует по крайней мере один потенциальный уникальный и высокое сродство ТФО-связывающий сайт в пределах каждого аннотированного гена в геноме человека 26. Каккогда – либо, для ясности, мы описали эти методы для использования конкретного псорален-конъюгированного TFO (pAG30) на определенной мутации репортер плазмиды (pSupFG1) в клетках U2OS человека , как мы использовали в Мукерджи & Vasquez, 2016 г. 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эффективное формирование ТФО-направленных ICL , зависит от двух важных факторов: во- первых, собственно буферные компоненты (например, MgCl 2) и время инкубации TFO с его субстратом ДНК – мишени (зависит от аффинности связывания TFO к цели дуплекс, а используемые концентрации); и во-вт?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить членов Васкес лаборатории за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения / Национального института рака [CA097175, CA093279 к КМВ]; и профилактики рака и Научно-исследовательский институт Техаса [RP101501]. Финансирование для открытого доступа бесплатно: Национальные институты здоровья / Национальный институт рака [CA093279 на КМВ].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
Referencias
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
- Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
- Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
- Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
- Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
- Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
- Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
- Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
- Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
- Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
- Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
- Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
- Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer – a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
- Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
- Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
- Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Bioquímica. 42, 2664-2671 (2003).
- Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Bioquímica. 44, 4188-4195 (2005).
- Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
- Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
- Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
- Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
- Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
- Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
- Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Bioquímica. 28, 5658-5664 (1989).
- Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
- Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
- Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
- Puri, N., et al. Minimum number of 2′-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Bioquímica. 41, 7716-7724 (2002).
- Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
- Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).
