Su Kullanımı Endokrin Aktivitesi Tarama Piyasada satılan<em> İn Vitro</em> Transaktivasyon biyolojik tayinler
Summary
A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Abstract
In vitro trans biyoanalizlere Bununla birlikte onların benimsenmesi ve yaygın uygulama nedeniyle standart yöntem ve sağlam, kullanıcı dostu teknoloji kullanılabilirlik eksikliği kısmen engellemiştir edilmiştir, su kalitesi izleme araçları olarak söz göstermiştir. Bu çalışmada, piyasada mevcut, bölünme-tutuklandı hücre hatları kantitatif çevresel kalite uzmanları ilgilendiren su örneklerinde bulunan kimyasalların endokrin faaliyeti taranması için kullanılmıştır. Kapsamlı kalite güvence / kalite kontrol dahil tek, standart bir protokol (QA / QC) denetler hücre tabanlı Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) testi kullanılarak (sırasıyla, ER ve GR) Östrojen ve Glukokortikoid Reseptör aktivitesi için geliştirilmiştir. Kaliforniya (ABD) tatlı su sistemlerinden tedavi belediye atık suyun ve yüzey suyunun numuneleri, katı faz ekstraksiyon kullanılarak çıkarılan ve standardize proto kullanarak endokrin aktivitesi için analiz edildiCol. Arka plan ve bitiş noktası özgü referans kimyasallar için doz-yanıt güvenilir ölçümü için gerekli gördüğü QA / QC kurallarına araya geldi. Yüzey su örnekleri için biyoassay tarama yanıtı büyük ölçüde saptanabilir değildi. Bunun aksine, ikincil arıtma tesisleri atık örnekleri ER 392 ng deksametazon GR / L ve 17 ng 17β-estradiyol / L'ye kadar, tahmini biyo-analizi eşdeğer konsantrasyonlarda (BEQs) ile en yüksek ölçülebilir aktiviteye sahiptir. bir tersiyer atık su örneği için biyolojik yanıtın, tedaviden sonra endokrin aktif kimyasalların daha düşük bir bakiye gösteren ikincil atık için ölçülen daha düşüktü. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilir kullanan nitro trans biyo-deneylerde, bölme durdurulmuş hücreli "setleri", su içinde endokrin aktivitesi için taranması için adapte edilebileceğini göstermiştir.
Introduction
Mevcut su kalitesi izleme doğru ve kesin yaban hayatı ve insanlar maruz kalma bir vekil olarak kimyasal kirleticilerin oluşumunu ölçmek için yeteneği esas alınmaktadır. Ancak, bu kimyasal-by-kimyasal izleme ve değerlendirme paradigma Karşı karşıya olduğumuz sürekli değişen kimyasal evren ayak uydurmak mümkün değil. Biz kader ve sentetik ve doğal kimyasalların etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmek, biz biyolojik etkileri beklenen hitap eden ölçüm araçları aramaya devam, ve aynı zamanda bu kimyasal üretim, kullanım ve çevre girdi değişikliklere karşı bağışık bulunmaktadır. Bu tür araçlar bilinmeyen ya da yeni kimyasallar ve dönüşüm ürünleri, dikkatimizi hak edip anlamak için özellikle önemlidir. Ayrıca, suda mevcut kimyasallar kompleks karışımlar zayıf tek tek kimyasal izleme ile ele alınmaktadır. Böylece, daha iyi adrese yüzey suları tha bu sorunları mevcut izleme araç kutusunu modernizasyonu sorunuyla karşı karşıyat tedavi atiksuyun ve kentsel / yağmursuyu ikinci tur atılmasını alırsınız.
Son yıllarda, biyoanalitik teknikler su kalitesi değerlendirmesi için tarama araçları olarak söz göstermiştir. Bilinen yoluyla hareket eden kimyasallara tepki özellikle, in'vitro biyoanalizlere olarak, eylemin 1,2 spesifik modları çevresel izleme topluma 3 büyük ilgi görmektedir. Sayısız araştırmalar içme, yüzey ve Atıksuların 4 -6 endokrin aktivitesini ölçmek için in vitro biyoanalizlere istihdam var. Ayrıca, biyo-deneylerde bir dizi molekül başlatma olaylar (örneğin, reseptör aktivasyonu), potansiyel olarak istenmeyen sonuç yolu ile zararlı etkileri ile bağlantılı olabilir 7,8 analiz hedef alır.
Su kalitesi değerlendirmesi için bioscreening evrimi açısından değerlendirilmiştir edilerek in vitro biyoassay uç noktaları farklı yüzlerce nispeten hızlı olmuştur onlarınyarar 9,10. Şu anda, Biyoanalizlerin sadece bir avuç su kaliteleri 5,6 arasında ayrım yeteneği gösterirken (laboratuarlar içinde) iyi ölçüm hassasiyeti elde gösterilmiştir. Özellikle muamele edilmiş atık suyun, östrojenler ve glukokortikoid steroid oluşumu başarılı olmuştur nitro trans aktivasyon 11,12 kullanarak oluşturmaktadır. kimin hücre hatları tescilli (ve dolayısıyla yaygın olarak kullanılabilir değil) Ancak bugüne kadar birçok çalışma istihdam var biyoassayler, sürekli bakım ve manipülasyon, ya da her ikisi gerektirir. Sonuç olarak, yetenek topluluk engellenmiş kalır su kaynaklarına bu tarama teknolojisini transfer etmek sonuçta, protokolleri standardize laboratuvarlar arası kalibrasyon egzersizleri, ve.
ABD ToxCast programı ile incelenen in vitro biyo-deneyler arasında en az bir teslimatçı "dondurma ve çözme, kullanımı kolay 13 ticari olarak temin edilebilir4; biçimleri. Bu takım durdurulmuş hücreli "setleri" tedavi 14 farklı seviyelerde ifade eden sudan ekstre kimyasal aktivitesinin ölçülmesi sağlam olması gösterilmiştir. satıcı protokolleri bireysel kimyasalların veya karışımların biyo ekrana mevcut olmasına rağmen onlar su numunelerinin uygulanabilir önce, bazıları değişiklik gerektirir. Arıtılmış atıksu çıkış 15, yağmursuyu akış 16, alıcı sular 17,18 ve daha yakın dönüştürülmüş su 19,20 su kalitesi, topluluğun ilgileneceği olan sulu ortam asal örnekleridir.
Bu çalışma, ticari olarak mevcut kullanarak su örneklerinde endokrin aktivitesini ölçmek için tek bir standart protokol sunar, bölünme-tutuklandı in vitro trans biyo-deneylerde. Biz tw için tepki arka doz cevap verebilen ve tekrarlanabilirlik kapsamlı bir değerlendirme ile protokol sağlamlığını gösterdiÖzellikle faiz Östrojen ve Glukokortikoid Reseptör transaktivasyonunun (ER ve GR, sırasıyla) o bitiş noktaları. protokol Kaliforniya'da tatlı su sistemlerinden tedavi atiksuyun ve yüzey suyunun ekran örneklerine uygulanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu 17β-estradiol (E2), ng / L konsantrasyonlarda 23,24 de, bu maddeler için garanti tarama çevresel estrojenler iyi belgelenmiş gücü. Bu çalışmada, atık su Pis su ER tepkisi (BEQ aralığı: 2,3-17 ng E2 / L) E2 / L ng 4 0.5 <yüzey suyuna (için BEQs ise, Avustralyalı atıksu arıtma tesislerinin 20 ikincil atık bildirilen biraz daha yüksek oldu ) E2 ng 11 / L) 16 yerde yüzey ve yağmur suyu (<1 için rapor aralığında idi. yüzey suyu numunelerinde ölçülen ER a…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
Materials
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. | |||
Referencias
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. . Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). . Direct potable reuse: a path forward. , (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
