Мы представляем протокол для применения интерферометрических фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM), 3-х мерной локализации одной молекулы методом микроскопии сверхвысокого разрешения, к визуализации актинового цитоскелета в прикрепленных клетках млекопитающих. Такой подход позволяет на основе света визуализации наноразмерных структурных особенностей, которые в противном случае остаются нерешенными обычными дифракционной оптической микроскопии.
Флуоресцентная микроскопия позволяет осуществлять прямую визуализацию конкретных биомолекул внутри клетки. Тем не менее, для обычной флуоресцентной микроскопии, пространственное разрешение ограничено дифракцией до ~ 200 нм в плоскости изображения и> 500 нм вдоль оптической оси. В результате, флуоресцентной микроскопии уже давно сильно ограничены в наблюдении ультраструктурных признаков внутри клеток. Новейшая разработка методов микроскопии сверхвысокого разрешения преодолела это ограничение. В частности, появление фотопереключаемых флуорофоров позволяет локализации на основе суперразрешением микроскопии, которая обеспечивает разрешающую способность приближающейся масштаб молекулярной длины. Здесь мы опишем применение трехмерного супер способа разрешения микроскопии на основе одиночной молекулы локализации микроскопии и многофазных интерферометрии, называемой интерферометрической фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM). Этот метод обеспечивает почти изотропный разрешения напорядка 20 нм во всех трех измерениях. Протоколы для визуализации волокнистый актин цитоскелета, в том числе подготовки образцов и эксплуатации прибора iPALM, описаны здесь. Эти протоколы также могут быть легко адаптированы и поучительно для изучения других ультраструктурных признаков в клетках.
Визуализация сложных клеточных структур уже давно неотъемлемой частью биологических идей и открытий. Хотя флуоресцентная микроскопия позволяет получать изображения клетки с высокой молекулярной специфичности, его разрешающая способность ограничена дифракции до ~ 200 нм в плоскости изображения (X, Y, или поперечный размер) и> 500 нм вдоль оптической оси (Z, или осевого размера) 1,2. Таким образом, наблюдение за ультраструктурных особенностей исторически ограничена электронной микроскопии (ЭМ). К счастью, в последнее время развитие суперразрешением микроскопии обходили это ограничение, что позволяет пространственное разрешение в 10 – диапазоне 1-6 100 нм. В частности, Суперразрешение подходы , основанные на одной молекулы локализации, известной под аббревиатурами , такими как PALM (фотоактивированного локализация микроскопия) 4, FPALM (флуоресценция фотоактивированного локализации микроскопия) 5 (d) STORM (прямая Стохастический оптическая микроскопия Реконструкция) 6,7, PAINT ( PoINT Накопление для работы с изображениями наноразмерных Топография) 8, GSDIM (State Ground Истощение Микроскопия с последующей индивидуальной молекулярной возвращения) 9 или SMACM (Single-Molecule Active-Control Микроскопия) 10, а также их 3-мерные (3D) реализации, такие как интерферометрическое PALM (iPALM) 11 или 3D-STORM 12, был ценным в выявлении новых идеи в наноразмерных организации многочисленных биологических структур, в том числе аксонов и синапсов 13, очаговые спайки 14,15, межклеточных соединений 16, ядерные поры 17 и центросомы 18-20, чтобы назвать несколько.
Еще одна особенность ультраструктурным в клетках, для которых Суперразрешение микроскопия потенциально полезным является актин цитоскелета. Комплекс плетение нитчатых (F) актина в клетки коры головного мозга играет существенную роль в контроле клеточного формы и механических свойств 21. Организация оF F-актин активно и динамично регулируется , хотя многочисленные регуляторные белки , которые оказывают сильное влияние на полимеризацию, сшивание, оборот, стабильность и топологию сети 22. Тем не менее, хотя характеристика F-актин сетчатой архитектуры имеет важное значение для механистической способности проникновения в суть разнообразных клеточных процессов, малый размер (~ 8 нм) из F-актина нитей затрудняет их наблюдение с помощью обычной дифракционной световой микроскопии; Таким образом, визуализация актина тонкой структуры до настоящего времени исключительно в исполнении EM. Здесь мы описываем протоколы для визуализации F-актин цитоскелета в прикрепленных клетках млекопитающих, используя суперразрешением метод микроскопии iPALM , чтобы воспользоваться его очень высокой способности точности в 3D 11,23. Хотя прибор iPALM является узкоспециализированной, инструкция по настройке такого инструмента был описан недавно 23, в то время как доступ к микроскоп iPALM , организованном ХоWard Hughes Medical Institute также доступны для научного сообщества с минимальными затратами. Кроме того, способы получения образцов , описанные здесь , непосредственно применимы к альтернативным подходам 3D Super Resolution, таких как те , которые основаны на астигматизма расфокусировки функции рассеяния точки (PSF) 12 или би-плоскости обнаружения 24, которые более широко доступны.
Отметим , что необходимый компонент для одной молекулы локализации на основе суперразрешением микроскопии в целом является фотопереключаемых Флуорофор 25, что позволяет трем критическим требованиям для одной молекулы локализации на основе суперразрешением микроскопии должны быть выполнены: я) высокой одной молекулы яркость и контрастность по отношению к фоновых сигналов; б) разреженный распределение одиночных молекул в заданном кадре изображения; и III) высокая пространственная плотность маркировки, достаточной для захвата профиля базовой структуры (также известный как Найквиста-Шаnnon критерий выборки) 26. Таким образом, для удовлетворительных результатов, особое внимание следует уделять одинаково на обоих надлежащей подготовки образцов для оптимизации флуорофора photoswitching и сохранить основную ультраструктуры, а также на приобретение приборов и аспектов экспериментов.
Оптическая система iPALM основана на 4-П двойственной оппозитных объективном конструкции, как показано на рисунке 1А. Установка построена с использованием как специально обработанную и коммерческие оптико-механические части, как описано ранее 23 и приведены в таблице</…
The authors have nothing to disclose.
YW и PK выражают глубокую признательность финансовую поддержку Сингапурского Национального исследовательского фонда, присужденной PK (СРН-NRFF-2011-04 и NRF2012NRF-CRP001-084). Мы также благодарим MBI открытые лаборатории и основные микроскопию средства для поддержки инфраструктуры.
optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
baseplate | local workshop | customized | |
turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |