El cultivo de células mesenquimales estromales humanas (hMSC) con suero autólogo, reduce los riesgos de rechazo por el material xenogénico y otros efectos negativos. También permite la recuperación de un subconjunto de progenitores mesodérmicos, que puede entregar hMSCs frescas. Incorporación de hMSCs en un coágulo de fibrina autóloga permite un manejo fácil y efectiva implantación quirúrgica.
Las células estromales mesenquimales humanas (hMSC) se cultivan in vitro con diferentes medios. Límites a su uso en la práctica clínica, sin embargo, dependen principalmente de los riesgos potenciales de riesgo biológico y la inflamación ejercidas por los nutrientes xenogénicos para su cultura. derivados de humanos o materiales recombinantes son los primeros candidatos de elección para reducir estas reacciones. Por lo tanto, los suplementos de cultivo y materiales de origen autólogo representan los mejores nutrientes y los productos más seguros.
A continuación, describimos un nuevo protocolo para el aislamiento y cultivo de hMSC médula ósea autólogas en condiciones – a saber, el suero derivado del paciente como un suplemento para el medio de cultivo y la fibrina como un andamio para la administración hMSC. De hecho, hMSC construcciones / coágulo de fibrina podría ser muy útil para varias aplicaciones clínicas. En particular, nos centramos en su uso en cirugía ortopédica, donde el coágulo de fibrina derivada de la propia sangre del donante permitióde suministro de células eficaz y de nutrientes / desechos intercambios. Para garantizar las condiciones de seguridad óptimas, es de suma importancia para evitar los riesgos de la transformación y el crecimiento excesivo de tejido hMSC. Por estas razones, el enfoque descrito en este documento también indica un ex vivo hMSC expansión mínimamente, para reducir la senescencia celular y cambios morfológicos, y de corto plazo osteo-diferenciación antes de la implantación, para inducir la especificación de linaje osteogénico, disminuyendo así el riesgo de una posterior no controlado proliferación.
Las células humanas mesenquimales del estroma (hMSC) representan una de las mejores fuentes de células para su uso en la ingeniería de tejidos para la promoción de la osteogénesis 1,2. Son fácilmente aisladas de médula ósea y otros tejidos adultos, y expresan marcadores de superficie típicos tales como CD90, CD105, CD73 1. Además, pueden diferenciarse en varios tipos de células, tales como osteoblastos, condrocitos y adipocitos 3. Sus efectos terapéuticos se atribuyen a su propiedades regeneradoras y tróficos 4. hMSCs se podrían utilizar en la cirugía ortopédica, así como en otras aplicaciones clínicas regenerativas. Se combinan preferiblemente con andamios, para mejorar el resultado clínico 5.
En comparación con otros materiales, el gel de fibrina muestra propiedades interesantes tales como adhesividad, la resorción y el transporte eficiente de los nutrientes, que lo hacen muy útil para una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos 6,7.
<p class = "jove_content"> El principal reto en la traducción de un enfoque de la ingeniería de tejidos en aplicaciones clínicas es la obtención de un andamio biocompatible y totalmente biosafe y un medio de cultivo libre de xeno que evita cualquier efecto infeccioso o reactiva.En nuestro método, gel de fibrina, derivado de la propia sangre del paciente, y el suero autólogo, para el cultivo in vitro hMSCs, fueron empleados como una posible solución terapéutica en el campo de la ortopedia 8.
Para fines clínicos, hMSCs generalmente se administran a través de dos procedimientos principales: (i) el procedimiento de "un solo paso" (es decir, la manipulación mínima), que permite que el trasplante de auto de la médula ósea, ya sea total o concentrado (es decir, células mononucleares), durante la cirugía; y (ii) el procedimiento de "dos etapas" (es decir, una extensa manipulación), que se basa en la expansión ex vivo de hMSC para aumentar su rendimiento antes de la implantación, y requiere GInstalaciones MP 9. Curiosamente, el cultivo de células con suero humano adulto en lugar de suero de ternera bovina permite la recuperación, junto con hMSCs, de un subconjunto de células (1 – 10% en cultivos mononucleares) llamados células mesodérmicas progenitoras (PSM), capaz de diferenciación in vitro en fresco hMSCs 10,11. Por lo tanto, hMPCs pueden jugar un papel significativo en el proceso de regeneración cuando se compara con hMSCs solo 12,13. Por último, empuja a corto plazo osteo-inducción hMSCs para comenzar su diferenciación en el linaje osteogénico sin perder su potencial de proliferación y viabilidad 12. Estos resultados confirman estudios previos que han informado mejorada es la formación de hueso in vivo por hMSCs, seguido de un precultivo en un medio osteogénico 14. Por otra parte, un coágulo de plasma autólogo como un andamio para la entrega celular puede ser fácilmente manipulado por el cirujano y moldeado para adaptarse a la forma de la cavidad del hueso 13.
Therefore, este método puede ser de gran utilidad para aquellos investigadores y clínicos que apuntan a traducir su terapia basada en hMSC desde el banco a la cabecera en las aplicaciones ortopédicas.
Los pasos críticos de este protocolo se refieren al uso de suero humano adulto y la proteasa, lo que permite obtener una terapia hMSC biosafe. En particular, el suero humano adulto permite el aislamiento y mantenimiento, mientras que la proteasa se asegura de la cosecha, de PSM. Estos son células inmaduras presentes en la médula ósea que pueden dar lugar a hMSCs frescas, asegurando así un depósito de hMSCs viables a lo largo del tiempo de cultivo. No todos los PSM se pueden recoger, ya que al aumentar el tiempo de exposición a la actividad de la proteasa es perjudicial para hMSC viabilidad. Por esta razón, de una incubación de la proteasa 10 min fue seleccionado como compromiso óptimo entre la recuperación de PSM y la viabilidad de los hMSCs. Otro paso crítico es el tiempo osteodifferentiation. De hecho, es una extensa osteodifferentiation vitro reduciría considerablemente la viabilidad celular, afectando así a la formación de hueso final en vivo. El último paso crítico consiste en hacer uso de un andamio biorreabsorbible autólogo, which se obtiene mediante la incorporación de las células (hMSC y PSM) en un gel de fibrina a partir de la coagulación de plasma.
Un paso clave para mejorar el rendimiento de los PSM es sembrar las células mononucleares en mayor concentración. El uso de procedimientos de aféresis para obtener plasma y tratamiento con gluconato de calcio hace que sea posible lograr suero autólogo en grandes cantidades. Se ha observado que el suero humano como un suplemento de medio es comparable al suero bovino fetal (FBS) en cultivos de hMSC. Sin embargo, en nuestra experiencia, un medio completo suplementado con FBS contribuye a la senescencia más rápido que el suero humano adulto. Un paso importante es el de la administración de una osteoinducción mínimo para hMSCs. De hecho, este tratamiento conduce a las células para diferenciar fácilmente hacia el linaje osteogénico, siendo por lo tanto útil para evitar aún más la transformación de células in vivo. Para mantener una buena viabilidad de hMSCs mínimamente osteoinduced, se recomienda seguir cuidadosamente las recomendaciones descritas en los pasos 6.5. und 8.2., incluyendo su manipulación, la centrifugación y medianas cantidades que se añade. Si un procedimiento de aféresis no está disponible, todavía es posible llevar a cabo este protocolo mediante la realización de múltiples sorteos de sangre para el paciente o, como alternativa, mediante la compra de una mezcla de sueros AB. Obviamente, con el fin de lograr este protocolo de la cabecera banco a, que es obligatorio tener fábricas de células GMP, o sus equivalentes, disponible.
Las limitaciones a la aplicación de esta técnica se refieren a la anémica, hematológicos-oncología y pacientes ortopédicos afectada por osteomielitis., Dibujo grandes cantidades de sangre de pacientes anémicos, deben ser evitados. En pacientes oncológicos, la calidad de las muestras de células se ve afectada por los tratamientos de quimioterapia, mientras que en los pacientes osteomielitis la infección puede afectar el resultado final. En todos los casos en los que el suero autólogo es insuficiente o inadecuada, combinada masculina AB sueros representan una buena alternativa.
El uso de células / clo de fibrinat construcciones para posibles aplicaciones clínicas es crucial para liberar una terapia celular autóloga por completo, lo que podría ser fácil de manejar y el molde durante la cirugía, lo que resulta en excelentes resultados para tratar el hueso no uniones 13. Para fines clínicos, hMSCs se administran normalmente a través de dos procedimientos principales: una manipulación mínima y una extensa manipulación 9. Para superar los problemas relacionados con una extensa cultivo ex vivo, tales como anormalidades en la morfología y el tamaño de 18 células, se realizó un breve periodo de tiempo la expansión de células in vivo y osteo-diferenciación (sólo 4 d) ex.
El protocolo libre de xeno se describe en este documento, junto con los cortos de expansión celular y osteodifferentiation veces, demostró ser relevante en las clínicas con el fin de obtener una producción de hueso rápida in vivo, sin evidencia de sobrecrecimiento y transformación de tejidos, confirmando así su eficacia y larga -term seguridad en la reparación ósea (Figura 5) </strong> 13.
La metodología presentada en este informe tiene como objetivo demostrar la eficacia y seguridad de hMSC la expansión in vitro en condiciones autólogas para su posible uso en cirugía ortopédica. Este protocolo emplea hMSCs aisladas de la médula ósea y se cultivaron en un medio suplementado con suero autólogo y embebidos en coágulos de fibrina autóloga, asegurando así una terapia celular completamente autólogo. La inducción osteogénica de dos veces, justo antes de la segunda separación, mejora la capacidad de hMSC a diferenciarse en osteoblastos. Como resultado de ello, esta técnica es particularmente adecuada para aplicaciones en defectos óseos, ya que no se limita a la pseudoartrosis. Las posibles aplicaciones futuras podrían implicar quiste astrágalo y la gestión de la pérdida de hueso.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.
Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
DMEM-LG, no glut, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
Glutamax (100X) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
Penicillin Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
Microtome | Leika | histological assay | |
May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |