293T 세포의 과도 Transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산

Summary

이 기술은 인간의 oncogene을 인코딩 복제 – 결함 retroviral 주식을 준비하는 효율적인 방법을 보여줍니다, 그리고 이후 마우스 모델에 myeloproliferative 질병의 유도에 사용.

Abstract

BCR – ABL 또는 성장 인자 수용체 – 파생 oncogenes (ZNF198 – FGFR1, BCR – PDGFRα 등) 같은 oncogenes에 의해 유도된 우리 연구실 연구 인간 myeloproliferative 질병. 우리는 이전에 관심 oncogene을 표현하는 레트로 바이러스에 감염된 골수 세포를 이식함으로써, 우리의 마우스 모델에서 인간과 같은 질병을 모델 공부하실 수 있습니다. 복제 – 결함이있는 레트로 바이러스 인간 oncogene을 인코딩 및 마커 (GFP, RFP, 항생제 저항 유전자 등) 293T 세포, 아데노 바이러스 E1A 유전자 제품에 의해 변형 인간 신장 상피 세포주를 사용하여 과도 transfection 프로토콜에 의해 만들어진 것입니다. 최대 쉽게 달성 50-80%의 transfection 효율을 가진 293 세포는 인산 칼슘 (카포 _4)에 의해 높은 transfectable되는 독특한 속성을 가집니다. 여기, 우리는 관심의 oncogene과 같은 포장이 경우 켓 또는 PCL을 구성 단일 게놈 EcoPak 플라스미드로 재갈 – POL – 환경을 포장 기능을 표현하는 플라스미드을 표현 retroviral 벡터와 함께 293 세포를 transfect에게 공동. 초기 transfection은 더욱 chloroquine의 사용에 의해 향상됩니다. ecotropic 바이러스의 주식, 문화 뜨는 48 시간으로 수집. 포스트 transfection은, C는 ° -80에 저장된 그런 다음 마우스 모델에서 이식에 사용할 수있는 변화의보기에 체외 연구에서 세포 – 선, 또는 마우스 골수 세포와 같은 기본 세포의 감염 사용할 수 있습니다 .

Protocol

3 – 5×10 6 셀 / 6cm 조직 cultureplate에서 변형, 플레이트 293T 세포 전에하세요. 참고 : 우리는 transfection하고 efficacyas 바이러스 생산 세포들의 편의를 위해 293T 세포를 사용합니다. 플라스미드 도우미가 도입되지 않는 한 이러한 세포가 바이러스를 포장에 부족한 수 있습니다. 첫 번째 아침 부드럽게 매체를 제거하고 4 ML 293T 세포 의대 25 MM의 Chloroquine을 포함로 바꿉니다. 1 ?…

Discussion

네 중요한 포인트는 좋은 바이러스 주식의 성공을 보장합니다

1. 293T 생산 세포들은 밀도에 도달 있도록, 그들은 매우 정기적인 일정에 따라 분할되었습니다 의미 매우 건강해야 자란 없었다면, 그리고 6cm 조직 문화 플레이트 당 3.5-5000000의 최적화된 밀도에 비쳐지게 만들려합니다 transfection의 아침에 접시의 80 %.
   
2. 셀 lysozomes을 안정화하고 핵에 도달 DNA의 분율을 증가하여 5 배 이상에 – chloro…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
293T cells	cell-line			Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well.
293T cell medium				DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro.
coding DNA plasmid				Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.)
EcoPak				also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env
2x HBS				For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight.
2M CaCl2		Sigma
miliQ H2O				sterile-filtered
Chloroquine				1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed.
6 cm plates				for tissue culture
Incubator				for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2.
10 cc sterile syringes				Sterile. One per virus type.
18G needles				single use, one per virus type.
45 um syringe filters
5 ml plastic tubes				Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes.
50 ml conical tubes
cryovials				2 and 4 ml, for virus aliquots.

All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl₂, 2x HBS, miliQ H₂O) and kept sterile.