Isolement et cytométrie de flux Analyse de Human Endocervical Gamma Delta cellules T
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
L'appareil reproducteur (FRT) système immunitaire muqueux femelle sert de la première ligne de défense. Une meilleure connaissance de la muqueuse génitale est donc essentiel pour la compréhension de la pathogénicité des différents agents pathogènes, y compris le VIH. delta Gamma cellules (GD) T sont le prototype de cellules «non conventionnelles» T et représentent un relativement petit sous-ensemble de cellules T définies par leur expression de récepteurs de cellules T (TCR hétérodimères) composées de chaînes gamma et delta. Ce qui les distingue des cellules T classiques et bien mieux connus auxiliaires CD4 + et de cellules T cytotoxiques CD8 + qui sont définis par les TCR alpha-bêta. GD cellules T montrent souvent la localisation spécifique des tissus et sont enrichis dans l'épithélium. GD cellules T orchestrent la réponse immunitaire à l'inflammation, la surveillance de la tumeur, les maladies infectieuses, et l'auto-immunité.
Ici, nous présentons une méthode pour isoler de manière reproductible et d'analyser les lymphocytes humains endocervicales intraépithéliale GD T. Nous have des échantillons de cytobrosse endocervicales utilisés par des femmes participant à interagences VIH Étude de l'infection des femmes (WIHS). La connaissance de GD cellules T interactions dans les conditions dans lesquelles il est une insulte à la muqueuse vaginale pourrait être appliquée à toute étude clinique dans laquelle la muqueuse vulnérabilité est abordée, y compris le développement de plus de microbicides.In vaginale, les connaissances sur les réponses des cellules muqueuses GD T a potentiel d'application de GD T immunothérapie à base de cellules dans le traitement de maladies infectieuses.
Introduction
Nous avons développé une méthodologie de l'aide d'échantillons de pinceau endocervical pour évaluer les cellules GD T intraépithéliale. Le canal endocervical est bordée par une seule couche d'épithélium. Lymphocytes intraépithéliaux représentent les lymphocytes de première ligne résidant dans la couche épithéliale qui peut rapidement initier des réponses immunitaires lors de la rencontre des microbes pathogènes 7, 8. Comprendre les événements immunologiques du compartiment intraépithéliale endocervical est important pour la conception de stratégies efficaces pour prévenir les infections, y compris le VIH.
Notre méthode peut être appliquée à des échantillons endocervicaux humains fraîchement récoltés ainsi que des cellules endocervicales congelés pour explorer davantage le rôle des cellules T GD intraépithéliale chez les femmes infectées par le VIH ou à risque d'infection par le VIH. L'objectif principal de ce protocole est de découvrir des événements immunologiques nouveaux dans le compartiment intraépithéliale endocervical et évaluatles réponses des lymphocytes T e GD comme un marqueur de la muqueuse de la vulnérabilité chez les femmes infectées par le VIH.
Les lacunes importantes dans les connaissances autour de l'immunité de FGT sont partiellement en raison de la difficulté dans la collecte et le traitement des échantillons muqueux avec succès. En outre, l'hétérogénéité complexe des cellules immunitaires de la muqueuse, et leur interconnexion avec l'autre, sont des défis majeurs pour l'identification des mesures cliniquement pertinentes qui reflètent l'état et la capacité du système immunitaire. Nous avons développé une méthode pour obtenir des cellules intraépithéliales hautement purifiées GD T qui peuvent être analysées plus en utilisant des technologies hautement multiplexées, unicellulaires qui peuvent être critiques pour identifier les mécanismes sous-jacents de l'immunité FRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Évaluation de la femme inférieure génitale vulnérabilité de la muqueuse des voies est une composante essentielle des études cliniques portant sur le risque d'acquisition et de la transmission du VIH. Typiquement FGT vulnérabilité à l' infection à VIH est évaluée en mesurant les modulateurs immunitaires solubles dans les sécrétions génitales (cytokines, des chimiokines et des peptides antimicrobiens) 12, 13. Cependant, ces biomarqueurs sont…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les participants à l'étude Miami WIHS pour leur volonté de participer à ce travail. Les données contenues dans ce manuscrit ont été recueillies par Interagency HIV Study des femmes Miami (WIHS). Le contenu de cette publication relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas la position officielle de la National Institutes of Health (NIH). Ce travail a été soutenu par l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses et de l'étude des infections interagences VIH des femmes (WIHS) [subvention numéro U01 AI103397], Institut national des allergies et des maladies infectieuses, National Institutes of Health [numéro de subvention P30AI073961], le Centre national pour l'avancement Sciences translationnelle et l'Institut national sur la santé des minorités et les disparités en santé, Institut national de la santé [numéro de subvention UL1TR000460 et 1KL2TR000461], et l'Institut national de la santé infantile et du développement humain, l'Institut national de la santé [numéro de subvention K23HD074489].
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
Referencias
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
