Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi
Summary
Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5′ cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.
Abstract
Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5′ mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5′ mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.
Introduction
Çeviri kontrol özellikle hücresel stres 1 dönemlerde, gen ifadesinin transkripsiyonel düzenlemeye eşit derecede önemli bir adım olarak ortaya çıkmaktadır. Çeviri kontrolünün odak noktası protein sentezi ilk adımları 7-methylguanosine ökaryotik başlatma faktörü 4E (eIF4E) bağlanma içeren başlatılması hız kısıtlayıcı adım (m 7 GTP) mRNA 2 5 'kapak olan . eIF4E eIF4A, bir RNA helikaz ve eIF4G, diğer çeviri faktörleri ve 40S 3 ribozom alımı için gerekli bir iskele protein içerir eIF4F adında bir trimerik kompleksinin bir parçasıdır. Normal fizyolojik şartlar altında, mRNA büyük çoğunluğu bir kapak-bağımlı mekanizma yoluyla çevrilir, hücresel stres dönemlerinde, insan mRNA yaklaşık% 10 1,4 intiation kap bağımsız çeviri izin verebilir 5 'UTRs içerir. Cap-bağımlı çeviri tarihsel eşanlamlı olmuşturous eIF4F ile, ancak, eIF4F stres özgü varyasyonlar eğilimi konu 5-8 haline gelmiştir.
Çeşitli hücresel stresler eIF4E aktivite rapamisin kompleksi 1 (mTORC1) memeli hedefin üzerinden bastırılmış neden olur. Bu kinaz hedefleri birinin aktivite artışı ile sonuçlanır stres altında güçleşir, (4E-BP) proteini 4E bağlayıcı değildir. Fosforilatlanmamış 4E-BP eIF4E ve bloklar eIF4G kap bağımlı çeviri 9,10 baskı neden ile etkileşim yeteneğini bağlanır. İlginç bir şekilde, eIF4E2 (veya 4EHP) adı eIF4E bir homologu, belki de stres kaynaklı baskı kaçmasına izin 4E-BP 11 için daha düşük bir afiniteye sahiptir. Gerçekten de, ilk bağlı eIF4G 12 ile etkileşim olmayışı nedeniyle çevrilmesinin bir bastıncısı olarak, özelliği, eIF4E2 hipoksik strese 6,13 sırasında 3 'UTR RNA hipoksiya tepki unsurları içeren mRNA yüzlerce çeviri başlatır. Bu aktivasyon, IeIF4G3, RNA hipoksik eIF4F kompleksi veya eIF4F H 6,13 teşkil protein motifi 4, ve hipoksi indüklenebilir faktör (HIF) 2a bağlayıcı etkileşimler yoluyla elde s. Normal koşullar altında, bir bastıncısı olarak eIF4E2 GIGYF2 ve ZNF598 14 ile bağlanmaktadır. Bu kompleksler, kısmen, Agaroz bağlanmış m 7 GTP afinite reçinesi ile tespit edilmiştir. Bu klasik yöntem 15 çeviri alanında standart ve en iyi ve en yaygın aşağı çekme de kap-bağlama kompleksleri izole etmek için tekniği kullanılmıştır ve in vitro bağlanma deneyleri 16-19 olduğunu. Kap-bağımlı çeviri makine arası değişen parçalar 6-8,13 gibi esnek ve uyarlanabilir ortaya çıkmaktadır olarak, bu yöntem hızla stres yanıtı katılan yeni kap-bağlayıcı proteinlerin tanımlamak için güçlü bir araçtır. Birkaç ökaryot model sistemler stres yanıtları gibi bir eIF4E2 homolog kullanmak göründükleri gibi Dahası, eIF4F değişimleri geniş etkileri olabilirC. thaliana 20 gibi, S. Pombe 21, D 22 melanogaster ve C 23 elegans.
Kanıt eIF4F değişiklikler sıkı koşullar stres, ancak normal fizyolojisi 24 dahil olmak sınırlandırılamaz düşündürmektedir. (Mikroelektronlar üzerinden ölçülen) (kılcal uçlarında) ya da dokular içinde dokulara oksijen kaynağı beyindeki 25% 2-6 arasında değişmektedir, akciğerlerde 26% 3-12, bağırsak 27,% 4 in 3,5-6% karaciğer 28, böbrek 29% 7-12, kas 30 içinde% 4 ve kemik iliği 31% 6-7. Hücreler ve mitokondri% 1,3 oksijen 32 daha az içerirler. Bu değerler hücrelerinin rutin olarak kültürlendiği olan çevre havası daha hipoksiye daha yakındırlar. Bu ne daha önce hipoksi özgü hücresel süreçleri fizyolojik bir ortamda ilgili olabileceği gibi düşündüm olduğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, eIF4F ve eIF4F H </sup> aktif fizyolojik oksijen ya da "physioxia" 24 maruz çeşitli insan hücre çizgileri belirgin havuzlar ya da mRNA sınıfları için başlatma katılabilir. Düşük oksijen, aynı zamanda uygun fetal gelişim 33 sürücüler ve hücreler genellikle daha yüksek çoğalma oranları, uzun ömürleri, daha az DNA hasarını ve physioxia 34 daha az genel stres yanıtları var. Bu nedenle, eIF4F lH olasılıkla fizyolojik koşullar altında seçme genin ifadesinde önemli bir faktördür.
Burada, sabit fizyolojik oksijen koşullarında veya doku mikroçevrelerde büyük olasılıkla daha fazla temsilcisi olan dinamik bir dalgalanma aralığı kültür hücreleri bir protokol sağlar. Bu yöntemin bir avantajı, hücre hipoksi iş istasyonu içinde lize olmasıdır. Hücre lizizi hipoksik hücre kültüründen geçiş diğer protokollere yapılan ne sıklıkta açık değildir. Hücreler genellikle ilk olarak küçük bir hipoksi inkübatör kaldırılır olmakoksijene hücresel yanıtı (bir ya da iki dakika) 35 hızlı olduğu ön parçalama, ancak oksijen bu poz biyokimyasal yollar etkileyebilir. Bazı kap-bağlayıcı proteinler ikinci bir baz ile etkileşimleri gerektiren veya bu nedenle bazı kapak interaktörler arıtma sürecinde gözden kaçabilir m 7 GTP, hidrolize olabilir. Agaroz bağlanmış enzimatik dayanıklı kap analoglarına Bu protokolde ikame edilebilir. Burada anlatılan yöntemi ile aktivite ve eIF4F H ve eIF4F diğer varyasyonları kompozisyonunu keşfetmek hücreler fizyolojik koşullar ya da stres yanıtları sırasında kullanmak karmaşık gen ifadesi makine ışık tutacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fizyolojik oksijen koşullarına maruz insan hücrelerinde kap bağlayıcı proteinlerin analizi, yeni oksijen regüle çeviri başlatma faktörlerinin tanımlanması için izin verir. MRNA veya başka bir kap ile ilişkili proteinlerin hem 5 'başlık için bu faktörlerin afinite m 7'ye olan ilişkilerine gücü ölçülebilir agaroz boncuklar GTP-bağlı. Bu tekniğin bir uyarı proteinlerin post-lisis kapağı bağlama potansiyelini ölçer, ancak, protein-protein etkileşimleri ve post-translasyo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
| 100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
| 150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15-cm culture dish |
| AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
| Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreital | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mL | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
| Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
| Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
| Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
| Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
| Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Protease Inhibitor Cocktail (100 x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
Referencias
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
- Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
- Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
- Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
- Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
- Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
- Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
- Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
- Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
- Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Bioquímica. 23 (2), 177-181 (1984).
- Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
- Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
- Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
- Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
- Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
- Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
- Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5′-3′ mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
- Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
- Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
- Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
- Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
- Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
- Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
- Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
- Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
- Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394 (2002).
- Gleadle, J., Ratcliffe, P. . Hypoxia. , (2001).
- Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
- Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
- Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
- Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
- Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
- Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
- Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs–a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
- Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).
