Aquí, presentamos protocolos de cultivo de células humanas para analizar los factores de iniciación de la traducción que se unen a la tapa 5' del ARNm durante las condiciones fisiológicas de oxígeno. Este método utiliza un análogo de tapa m7GTP ligado a agarosa y es adecuado para investigar los factores de unión a la tapa y sus socios que interactúan.
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Artículo de método
Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas
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Resumen
Resumen
El control traslacional es un punto focal de la regulación génica, especialmente durante los períodos de estrés celular. La traducción dependiente de la tapa a través del complejo eIF4F es, con mucho, la vía más común para iniciar la síntesis de proteínas en las células eucariotas, pero ahora están surgiendo variaciones específicas de estrés de este complejo. La purificación de proteínas de unión a la tapa con una resina de afinidad compuesta por m7GTP unido a agarosa (un análogo de la tapa del ARNm 5') es una herramienta útil para identificar los factores implicados en la regulación del inicio de la traducción. La hipoxia (bajo nivel de oxígeno) es un estrés celular que se produce durante el desarrollo fetal y la progresión tumoral, y depende en gran medida de la regulación de la traducción. Además, recientemente se informó que los órganos humanos adultos tienen un contenido de oxígeno más bajo (fisioxia 1-9% de oxígeno) que está más cerca de la hipoxia que el aire ambiente donde las células se cultivan de forma rutinaria. Con la caracterización en curso de un complejo eIF4F hipóxico (eIF4FH), existe un interés creciente en comprender el inicio de la traducción dependiente del oxígeno a través de la tapa de ARNm 5'. Recientemente hemos desarrollado un método de cultivo de células humanas para analizar proteínas de unión a la tapa que están reguladas por la disponibilidad de oxígeno. Este protocolo enfatiza que el cultivo celular y la lisis se realicen en una estación de trabajo de hipoxia para eliminar la exposición al oxígeno. Las células deben incubarse durante al menos 24 horas para que los medios líquidos se equilibren con la atmósfera dentro de la estación de trabajo. Para evitar esta limitación, se pueden agregar medios preacondicionados (desoxigenados) a las celdas si se requieren puntos de tiempo más cortos. Ciertas proteínas de unión a la tapa requieren interacciones con una segunda base o pueden hidrolizar el GTP m7, por lo tanto, es posible que algunos interactores de la tapa se pierdan en el proceso de purificación. La agarosa unida a análogos de sombreros enzimáticamente resistentes puede sustituirse en este protocolo. Este método permite al usuario identificar nuevos factores de traducción regulados por oxígeno implicados en la traducción dependiente de la tapa.
Introducción
Control de la traducción está emergiendo como un paso igualmente importante para la regulación transcripcional de la expresión génica, especialmente durante los períodos de estrés celular 1. Un punto central de control de la traducción está en la etapa limitante de la velocidad de iniciación, donde los primeros pasos de la síntesis de proteínas implican la unión del factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E) a la 7-metilguanosina (m 7 GTP) 5 'cap de mRNAs 2 . eIF4E es parte de un complejo trimérico llamado eIF4F que incluye eIF4A, una helicasa de ARN, y eIF4G, una proteína de andamiaje necesario para la contratación de otros factor....
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Protocolo
1. Preparativos para el cultivo celular
- Comprar acciones disponibles en el mercado de las células humanas.
NOTA: Este protocolo utiliza el carcinoma colorrectal y HCT116 células humanas primarias epiteliales tubulares renales proximales (HRPTEC). - Hacer 500 ml de medio para el cultivo de HCT116: de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) media / alta de glucosa suplementado con 7,5% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S).
- Hacer 500 ml de medio para el cultivo de HRPTEC: medio celular epitelial suplementado con 5% FBS, 1% de suplemento de crecimiento de células epiteliales, y 1% P / S.
- Prepar....
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Resultados
Análisis de Capacidad del casquillo de unión en respuesta al oxígeno de eIF4E y eIF4E2 en un m 7 GTP columna de afinidad
Las figuras 1 y 2 representan transferencias Western de m 7 GTP afinidad purificación típica de las dos principales proteínas de unión del casquillo en respuesta a las fluctuaciones de oxígeno en dos líneas celulares humanas: células primarias humanas rena.......
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Discusión
El análisis de proteínas de unión a la tapa-en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas pueden permitir la identificación de nuevos factores de iniciación de traducción regulada de oxígeno. La afinidad de estos factores para la tapa 5 'del mRNA u otras proteínas de tapa asociada se puede medir por la fuerza de su asociación a la m 7 GTP ligada perlas de agarosa. Una advertencia de esta técnica es que mide el potencial de unión de topes de proteínas post-lisis, pero se realiza en con.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y el Ministerio de Investigación e Innovación de Ontario.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| γ-aminofenil-m7GTP agarosa C10 perlas enlazadas | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarosa ligada a la <>7GTP |
| Placa de cultivo | Corning | 877222 | 10 cm placa de cultivo de 150 |
| mm | Thermofisher | 130183 | plato de cultivo de 15 cm |
| AEBSF Clorhidrato ACROS | Orgánicos | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Control de perlas de agarosa |
| Azul de bromofenol | Fisher | BP112-25 | Componente del tampón de carga SDS-PAGE |
| 1,5 ml Tubos de centrífuga | FroggaBio | 1210-00S | Se utiliza para centrifugar pequeños volúmenes |
| 15 ml Tubos de centrífuga cónicos Fisher | 1495970C | Se utiliza en el cultivo de células primarias | |
| Definido Inhibidor de tripsina | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreitol | Fisher | BP172-25 | DTT |
| celular epitelial (kit completo) | ScienCell | 4101 | Incluye suplementos de suero y factor de crecimiento) |
| Glicerol | Fisher | BP229-1 | Componente del tampón de carga SDS-PAGE |
| 100 mM Guanosina 5'-trifosfato, 1 ml | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 carcinoma colorrectal | ATCC | CCL-247 | Línea celular de cáncer humano |
| Células epiteliales tubulares proximales renales humanas | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/Alta glucosa | GE Life Sciences | SH30022.01 | Medios estándar para el cultivo de células humanas |
| Solución de hipoclona penicilina-estreptomicina | GE Life Sciences | SV30010 | Componente antibiótico de DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Estación de trabajo de hipoxia |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Componente detergente del tampón de lisis |
| Fosfato monopotásico | Fisher | P288-500 | KH2PO4Cloruro de |
| potasio | Fisher | P217-500 | KCl |
| Cloruro de magnesio | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Cloruro de sodio | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Fluoruro de sodio | Fisher | 5299-100 | NaF (componente inhibidor de la fosfatasa del tampón de lisis) |
| Fosfato disódico | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine | Serum Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Cóctel de inhibidores de proteasa (100x) | Señalización celular | 58715 | Componente del tampón de lisis |
| Dodecil Sulfato de sodio | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Ortovanadato de sodio | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Componente de tampones |
| 0,05% Tripsina-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Tripsina utilizada para separar las células adherentes |
Referencias
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), ....
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Reimpresiones y permisos
