En direct d'imagerie cellulaire et l'analyse 3D des antagonistes des récepteurs de type 1a traite des transfectées embryonnaires humaines cellules rénales Utilisation Microscopie confocale
Summary
Nous présentons ici un protocole de cellules d'image exprimant vert fluorescent type récepteurs de l'angiotensine 1a protéine marqués pendant endocytose initiés par le traitement de l'angiotensine II. Cette technique comprend les lysosomes d'étiquetage avec un second marqueur fluorescent, puis en utilisant un logiciel pour analyser la co-localisation du récepteur et lysosome en trois dimensions au fil du temps.
Abstract
Imagerie des cellules vivantes est utilisé pour capturer simultanément des images en accéléré des récepteurs de type angiotensine 1a (AT 1a R) et des compartiments intracellulaires dans des cellules embryonnaires humaines transfectées de rein-293 (HEK) après stimulation par l' angiotensine II (Ang II). Des cellules HEK sont transfectées transitoirement avec l' ADN plasmidique contenant AT 1a R marqué avec le renforcement de la protéine fluorescente verte (EGFP). Lysosomes sont identifiés par un colorant fluorescent rouge. images en direct de cellules sont capturées sur un microscope à balayage laser confocal après stimulation Ang II et analysées par le logiciel en trois dimensions (3D, voxels) au fil du temps. imagerie des cellules vivantes permet les enquêtes sur le trafic de récepteur et évite les facteurs de confusion liés à la fixation, et en particulier, la perte ou le déplacement artefactuelle des récepteurs membranaires EGFP-marqués. Ainsi, les cellules individuelles sont suivies dans le temps, la localisation subcellulaire des récepteurs peut être imagée et mesurée. Les images doivent être acquises sufficiently rapidement pour capter le mouvement des vésicules rapide. Pourtant, à des vitesses d'imagerie plus rapides, le nombre de photons collectés est réduit. Compromis doivent également être prises dans le choix des paramètres d'imagerie comme la taille de voxel afin de gagner de la vitesse d'imagerie. applications importantes de l'imagerie des cellules vivantes sont d'étudier le trafic de protéines, la migration, la prolifération, le cycle cellulaire, l'apoptose, l'autophagie et interaction protéine-protéine et de la dynamique, pour ne citer que quelques-uns.
Introduction
L'objectif global est d'obtenir des données quantitatives dans le temps et l'espace de colocalisation des récepteurs avec des organites intracellulaires spécifiques après un traitement par un agoniste du récepteur. Ainsi, l'objectif immédiat est ici de capturer time-lapse images confocales de lysosomes et un transmembranaire couvrant récepteur dans les cellules de rein embryonnaire humain (HEK) après transfection et à assembler ensuite et analyser les données d'imagerie en 3D pour mesurer quantitativement la distribution du récepteur à lysosomes. Enquête sur le trafic simultané d'un récepteur transmembranaire avec les lysosomes ou d'autres organites durant l'endocytose, lorsqu'il est activé par le ligand du récepteur peut aider à déterminer comment le récepteur transmembranaire est régulée dans des conditions physiologiques et physiopathologiques.
AT 1a R est présumée être dégradée dans les lysosomes après un traitement par Ang II dans le modèle des systèmes de cellules, principalement HEK293 1 , bien que la majorité des receptors sont principalement localisés dans les endosomes multivésiculaires de recyclage pour le recyclage à la suite de la membrane plasmique tandis que la masse du ligand, l' Ang II est dégradé dans le lysosome 2, 3, 4, 5. Plus récemment, Li et al. démontrée en utilisant le transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) , et la microscopie de fluorescence d'imagerie à vie (FLIM) techniques qui colocalise AT 1a R (à ~ 10 nm à l' échelle) avec LAMPE1, une protéine de la membrane lysosomale qui suggère qu'au moins une partie du récepteur est ciblé vers et dégradé 6 par les lysosomes. Ces auteurs ont noté que la chloroquine inhibiteur de lysosomale bloqué AT 1a association R-LAMP1 qui est compatible avec les précédents rapports suggérant que l'effet de la chloroquine est de bloquer la fusion des endosomes tardifs ou autophagosomes avec lysosomes. D' autres approches indirectes pour déterminer AT 1a R localization dans les lysosomes ont utilisé bafilomycine, un inhibiteur de lysosomale pour déduire AT 1a R présence dans les lysosomes 3, 4, 5, 6, 7, 8.
imagerie des cellules vivantes évite les effets potentiels de la fixation sur le volume cellulaire et la perte / gradation / redistribution des récepteurs de la GFP chimère. Des études antérieures se sont appuyés sur des cellules fixées afin de déterminer la colocalisation ou de co-occurrence du récepteur avec les lysosomes ou en utilisant des cellules vivantes marquées avec des mères porteuses de liaison aux récepteurs tels que le β-arrestine 1, 2, 3, 4, 5, 6. imagerie des cellules vivantes d'autres GPCR utilisant confocale à disque tournant ou balayage laser point confmicroscopes vecinales équipés de Gaasp ou HYD détecteurs ont permis aux enquêteurs d'observer l'internalisation et la traite des récepteurs dans des cellules individuelles imagées en z-piles à 30 s intervalles 9, 10. Cependant , même lorsque la cellule z-piles vivantes sont rapidement collectées, l' analyse ne peut se produire après la sélection d'un seul plan dans chaque pile, soit en 2D 10. Bien que cela puisse être suffisant pour l' étude du récepteur de kinase GPCR ou tyrosine intériorisé en question, les AT 1a Rs accumule dans des vésicules qui changent la taille et la position au fil du temps et sont donc par nature plus difficiles à échantillonner de manière adéquate à l' aide d' une tranche représentant unique à chaque point de temps. Pour déterminer soigneusement le tracé du étiqueté AT 1a R à travers la cellule et de détecter chaque sous – population de vésicules différentes en taille et position, nous avons mis au point une méthode pour l' imagerie 3D et l' analyse 3D pour suivre ces changements et d'être utilisé en conjonction avec l'étiquetage des différents compartiments intracellulaires tels que les lysosomes.
Les enquêteurs peuvent utiliser ce protocole pour l' imagerie des cellules vivantes pour visualiser directement le mouvement d'AT 1a R dans la cellule et son transfert à compartiments subcellulaires après stimulation Ang II. compartiments subcellulaires sont étiquetés avec des chimères de protéines fluorescentes ou d'autres marqueurs fluorescents. Ce protocole peut également être utilisé comme une première approche pour localiser les récepteurs dans les organites intracellulaires avec une résolution minimale de 200 nm afin de comparer muté par rapport à des récepteurs de type sauvage ou de détecter les changements suivants traitements pharmacologiques. La technique est accessible étant donné qu'il peut être réalisé sur un microscope confocal équipé pour l'imagerie des cellules vivantes. La facilité relative de cette approche contraste avec l' expertise et l' équipement nécessaires à la réalisation de FRET / FLIM / techniques BRET qui détectent les interactions moléculaires 6 accrue,"xref"> 11. Ces mesures définissent des interactions protéine-protéine avec une résolution élevée (~ 10 nm) et la localisation au sein d'organites subcellulaires est inférée. Ces techniques plus avancées sont utilisées pour suivre et mieux définir les interactions moléculaires d'intérêt, plutôt que le passage des récepteurs à travers des compartiments subcellulaires, et ils montrent directement les interactions protéine-protéine à des moments et des endroits spécifiques dans la cellule 11. FLIM, une technique de FRET indépendante de la concentration de l'accepteur, est le plus souvent effectué sur des échantillons fixes depuis l'acquisition d'images est plus lente. En revanche, le ratio FRET fournit l'imagerie rapide et haute résolution colocalisation des protéines interagissant. L'inconvénient de rapport FRET est que l' imagerie utilise épifluorescence Widefield pour gagner de la vitesse d'imagerie et d'inclure toute la cellule, ce qui réduit la résolution et le contraste des organites 12. transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) est un autretechnique avancée qui a été appliquée à des GPCR pour mesurer l'acquisition de la proximité moléculaire 11 au fil du temps. Dans cette technique, un fluorophore protéique est moléculairement divisée et chaque moitié liée à l'une des deux protéines en question. Lorsque les deux protéines d'intérêt se lient les uns des autres, les parties de l'étiquette chimérique ré-assembler pour acquérir la fluorescence et la fluorescence accrue quantifiée au fil du temps.
Ici, nous présentons une technique simple pour l' imagerie des cellules vivantes couplé avec l' image de quantification pour étudier le trafic d'AT 1a R dans la cellule sur Ang II stimulation et le changement potentiel de livraison de intériorisé AT 1a R à lysosomes après stimulation Ang II. L'utilisation finale de cette technique est de caractériser les différences dans le trafic membranaire comparant type sauvage et récepteurs mutés. Ces différences aideront à identifier le mécanisme (s) qui ont un impact des activités physiologiques de AT 1a R leading à la régulation de la pression artérielle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des expériences préliminaires présentées ici montrent que sur un parcours de temps assez court de 24 minutes, pas de changement notable dans la livraison d'AT 1a R-GFP aux lysosomes a eu lieu. En général, la livraison des récepteurs internalisés aux lysosomes pourrait se produire dès 15-20 min. Cette expérience est en accord avec l'hypothèse selon laquelle la majeure partie du internalisé AT 1a R est destinée aux grands endosomes périnucléaire. La preuve que certains au moins…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux de recherche présentés dans ce manuscrit a été soutenu par la subvention R01 HL121456-01A1 à Kathryn Sandberg. Ce travail a été soutenu en plus par la disponibilité d'un Leica SP8 AOBS dans le Microscopy and Imaging Shared Resource (MISR) à Georgetown University Medical Center, qui est partiellement financé par P30-CA051008 des National Institutes of Health des États-Unis d'Amérique. Nous tenons à remercier Leica aide d'imagerie SP8 par Peter Johnson, et l'utilisation du Zeiss LSM880 dans le laboratoire de Thomas Coate, Département de biologie de l'Université de Georgetown avec l'aide de l'imagerie fournie par Alma Arnold de Carl Zeiss Microscopie LLC. Le contenu de ce manuscrit est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
Referencias
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