Summary
Este documento explica la aplicación de imagen fluorescente utilizando una sonda de formación de imágenes óptico activable para visualizar la actividad in vivo de las metaloproteinasas de matriz de teclas en dos modelos experimentales diferentes de inflamación.
Abstract
Este documento describe un método no invasivo para metaloproteinasas de la matriz de formación de imágenes (MMP) -Actividad por una sonda fluorescente activable, a través de fluorescencia in vivo de imágenes ópticas (OI), en dos modelos diferentes de ratón de inflamación: a la artritis reumatoide (RA) y un contacto reacción de hipersensibilidad (CHR) modelo. La luz con una longitud de onda en la ventana de infrarrojo cercano (NIR) (650 - 950 nm) permite una penetración más profunda del tejido y la absorción de la señal mínima en comparación con las longitudes de onda por debajo de 650 nm. Las principales ventajas utilizando fluorescencia OI es que es barato, rápido y fácil de implementar en diferentes modelos animales.
sondas fluorescentes activables son ópticamente silenciosa en sus estados inactivados, pero se convierten en altamente fluorescente cuando es activado por una proteasa. MMP activadas conducen a la destrucción de tejidos y juegan un papel importante para la progresión de la enfermedad en las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (DTHRs) como la AR y CHR. Además, las MMPs sonLas proteasas clave para el cartílago y la degradación ósea y son inducidas por macrófagos, fibroblastos y condrocitos en respuesta a citoquinas pro-inflamatorias. Aquí se utiliza una sonda que se activa por la clave MMPs como MMP-2, -3, -9 y -13 y describir un protocolo de imagen para la fluorescencia infrarroja cercana OI de MMP actividad en la AR y el control de ratones 6 días después de la inducción de la enfermedad, así Como en ratones con reuma aguda (1x desafío) y crónica (5x desafío) en el oído derecho en comparación con oídos sanos.
Introduction
Las enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide (RA) o psoriasis vulgar se clasifican como de tipo retardado reacciones de hipersensibilidad (DTHRs). 1 RA es una enfermedad autoinmune común caracterizada por sinovitis erosiva y destrucción de las articulaciones. 2 articulaciones artríticas inflamadas demuestran la infiltración y proliferación de células inflamatorias, un aumento de la expresión de las células pro-inflamatorias que conducen a la formación de pannus, cartílago y destrucciones óseas. 3, 4 La escisión de moléculas de matriz extracelular, como el colágeno por metaloproteinasas de la matriz (MMPs), es esencial para la conversión de tejido y la angiogénesis y causa destrucciones tisulares. 5, 6 de contacto reacciones de hipersensibilidad (CHR) se caracterizan por la agregación de los neutrófilos que conduce a un estallido oxidativo. 7 De manera similar a la AR, las MMP en CHR son INVOLved en la conversión de tejido, la migración celular y la angiogénesis con el fin de establecer la inflamación crónica.
Para investigar RA, se utilizó la isomerasa de glucosa-6-fosfato (GPI) de inyección -suero modelo de ratón. 8 El suero de los ratones K / BxN transgénicas que contienen anticuerpos contra GPI, se inyectó en ratones BALB / c tratados previamente después de lo cual la inflamación reumática comenzó a desarrollar dentro de las 24 h con un máximo de la hinchazón del tobillo en el día 6 después de la inyección GPI-suero (véase 1.1). Para analizar CHR crónica, C57BL / 6 ratones fueron sensibilizados con trinitroclorobenceno (TNCB) en el abdomen. La oreja derecha fue desafiado hasta 5 veces empezando 1 semana después de la sensibilización (véase también 1.1 y 1.2).
No invasiva pequeña OI animal es una técnica basada en la investigación in vivo de fluorescent-, chemiluminescent- y bioluminiscentes señales, que se utilizan principalmente en la investigación preclínica. Los datos semi-cuantitativos adquirida da una visión de la Molecmecanismos Ular en los órganos y tejidos del saludables, así como modelos animales experimentales enfermas, y permite longitudinal seguimiento mediciones (por ejemplo, para evaluar los perfiles de respuesta terapéutica in vivo). Una gran ventaja de estudios longitudinales es la reducción del número de animales, como los mismos animales se pueden medir en los estudios de seguimiento en varios puntos de tiempo en lugar de utilizar diferentes ratones por punto de tiempo. La resolución de OI permite imágenes funcionales detalladas de los órganos y estructuras de tejido incluso más pequeños en animales de experimentación.
El uso de filtros de excitación y emisión específicos con un espectro de transmisión estrecha, una protección contra la luz dispersada por una prueba de luz "caja oscura" y un dispositivo de carga acoplada sensible (CCD), que se enfría en muchos dispositivos hasta -70 ° C , permite altamente específica y mediciones sensibles de señales de fluorescencia.
Mediante el uso de agentes fluorescentes con excitación-yLos espectros de emisión en la ventana de fluorescencia del infrarrojo cercano (650 - 950 nm), se pueden mejorar significativamente las relaciones señal / ruido. La ventana de fluorescencia del infrarrojo cercano se caracteriza por una absorción relativamente baja de la señal por la hemoglobina y el agua, así como por una baja fluorescencia de fondo. 9 Esto permite una profundidad de penetración de hasta 2 cm en el tejido de animales pequeños. Las sondas OI pueden dirigirse directamente a un objetivo ( por ejemplo, mediante un anticuerpo marcado con fluorescencia) o pueden activarse en el tejido diana ( por ejemplo, por proteasas). Las sondas OI activables son opticamente silenciosas en su forma inactivada debido a la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) a un resto de extinción, que transfiere la energía de excitación dentro de la molécula a otro dominio. Si el colorante es escindido (por una proteasa, por ejemplo) la energía ya no se transfiere dentro de la molécula y una señal fluorescente puede ser detectada por OI. Esto permite el diseño de sondas OI con alta especificidadY para distintos procesos biológicos y excelentes relaciones señal / ruido.
El siguiente protocolo explica en detalle la preparación de los animales, las mediciones de OI usando una sonda de OI Activable para visualizar la actividad de MMP-2, -3, -9 y -13 in vivo y dos modelos experimentales de inflamación (RA, CHR).
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Protocol
Todos los procedimientos descritos en este documento siguieron las directrices y estándares internacionales de cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Bienestar y Ética Animal de la Comisión Nacional de Tuebingen, Alemania. Se mantuvieron ratones BALB / c y C57BL / 6 de 8 - 12 semanas de edad en un ciclo de luz: oscuridad de 12 h: 12 h y se alojaron en IVCs y condiciones ambientales estandarizadas a 22 ± 1ºC en grupos de 2 - 5 con agua y Acceso al alimento ad libitum .
1. Preparación del material
- Diluir el colorante OI para la obtención de imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano de acuerdo con la hoja de datos respectiva directamente antes de la inyección. El colorante OI activable (sonda comercial con una excitación a 680 nm) para medir las MMP in vivo está listo para su uso a una concentración de 20 nmol en 1,5 ml 1x PBS. Agite suavemente o vórtice la solución antes de usarla. El colorante OI puede almacenarse a 2-8 ° C durante hasta 6 meses cuando está protegido de la luz. Para la administración intravenosa (iv) las inyecciones se preparan de un catéter venoso. Use un 20 U (0,5 ml) jeringa de insulina lleno de solución salina al 0,9% (que contiene 10 unidades de inyección de heparina en 50 ml), y una aguja de calibre 30 unida a un catéter de polietileno. Inyectar la dosis recomendada de 2 nmol por ratón del colorante OI.
2. La inducción de la artritis reumatoide y la reacción de contacto hipersensibilidad crónica
- Artritis reumatoide:
- Diluir 100! L de suero (a base de ratones K / BxN 10) anticuerpos que contienen (AB) contra isomerasa de glucosa-6-fosfato (GPI) 1: 1 con 1x PBS (200 l) para inducir la RA. Almacenar el suero diluido a -80 ° C. Los procedimientos detallados para la inducción de la RA se describen por Monach et al. 8.
- Para inducir la RA, levante cada ratón suavemente por la cola y se inyecta 200 l de la intraperitoneal suero diluido (ip) en el día 0 de tEl experimento Después de la inyección, coloque el ratón directamente en su jaula.
- Opcionalmente, se miden los diámetros del tobillo de cada tobillo, antes de las inyecciones de AB y se define una "puntuación artrítica" ( Figura 1A ). Continuar midiendo la hinchazón del tobillo diariamente hasta el día 6 después del suero GPI usando un dispositivo de medición mecánico (micrómetro).
- Inyectar el colorante OI activable (paso 1.1 - 1.2), para medir la actividad MMP in vivo iv en la vena de la cola de ratones RA Al día 5 después de la inyección de GPI-suero y en la vena de la cola de ratones de control. Realizar experimentos de imagen óptica 24 h después de la inyección de la vena de la cola.
- Reacción de hipersensibilidad de contacto:
- Para la sensibilización de ratones C57BL / 6, preparar una solución de TNCB al 5% disuelta en una mezcla 4: 1 de acetona / aceite.
- Anestesiar los ratones C57BL / 6 usando isoflurano al 1,5% vaporizado en oxígeno al 100% (1,5 l / min). Una vez que los ratones son anestesiados, colóquelo en un loco (Un corte de 5 ml de jeringa de polietileno, conectado al tubo de 1,5% en volumen de isoflurano) y mantener la anestesia. Aplique el ungüento del ojo del veterinario en los animales anestesiados para prevenir sequedad de los ojos mientras que anestesiado.
- Afeitar el abdomen con cuidado (2 x 2 cm) usando un pequeño cortador de pelo animal. Evite dañar la piel, ya que esto puede llevar a señales fluorescentes inespecíficas dentro del animal y puede influir en los resultados del estudio.
- Aplique lentamente 80 μL de la solución de TNCB al 5% en el área del abdomen afeitado usando una pipeta de 100 μl para sensibilizar al animal. Coloque el ratón suavemente de nuevo en su jaula teniendo cuidado de asegurar que los ojos del ratón no entrar en contacto con la ropa de cama para evitar lesiones de la córnea y evitar las bajas temperaturas del cuerpo durante la fase de recuperación.
- Seis días después de la sensibilización, se prepara una solución de TNCB al 1% (disuelta en una mezcla 9: 1 de acetona / aceite) y se aplican 20 μl en la oreja derecha utilizando una pipeta para provocar CHSR aguda y crónica."> 1
- Comience con el desafío st 1 en ambos lados de la oreja derecha con 20 l de solución de TNCB 1% usando una pipeta de 100 l y repetir el reto cada segundo día hasta cinco veces (día 15 después de la sensibilización) para provocar CHR (Figura 1B) . Medir grosor de la oreja al día, utilizando un dispositivo de medición micrómetro.
- Inyectar el colorante OI activable (una sonda comercial con excitación a 680 nm) (etapa 1/1 a 1/2) para medir la actividad de MMP in vivo en ratones CHR 12 h después del desafío. Realizar experimentos de imagen 24 h después de la inyección en vena de cola óptica (iv).
3. Preparación de los animales para Imaging óptico
- Chow Interruptor de ratón (al menos 3 días antes de imagen) a la baja o no de fluorescencia Chow (por ejemplo, libre de manganeso) para evitar la interferencia de auto-fluorescencia (alrededor de 700 nm) con la señal de fluorescencia de los agentes de OI utilizados.
- Colocar el animal enA una caja de anestesia y anestesiar usando isoflurano al 1,5% en volumen vaporizado con oxígeno (1,5 l / min) (el oxígeno puede ser reemplazado por aire, pero necesita ser estandarizado dentro de un experimento).
- Cuando el ratón está visiblemente anestesiado, colóquelo en un cono de nariz hecho a sí mismo (construido por una jeringa de polietileno de 5 ml cortada, conectada al tubo de isoflurano al 1,5% en volumen) y mantenga la anestesia.
- Afeitar el animal cuidadosamente en el sitio de destino (2 cm x 2 cm) usando un pequeño cortador de pelo animal. Evite dañar la piel, ya que esto puede llevar a señales fluorescentes inespecíficas dentro del animal y puede influir en los resultados del estudio.
NOTA: Los pelos pueden absorber la señal de fluorescencia durante OI (dependiendo de la cepa del ratón, se observa más o menos absorción) dependiendo de la región de interés (ROI). - Para la inyección intravenosa, coloque la cola del ratón en agua caliente, para inducir vasodilatación, limpie suavemente la piel en el lugar de la inyección con alcohol y comience colocando el catéter enel sitio distal de la cola. Colocar el "corte" borde de la aguja en, en un ángulo de 20 ° en la vena de la cola y probar la correcta colocación del catéter por la re-suspensión de la jeringa.
- Si el catéter está colocado correctamente, sustituir la jeringa e inyectar la sonda OI (2 nmol). Después de la inyección, reemplazar la jeringa e inyectar 25 l de solución salina al 0,9% a totalmente claro el volumen muerto del tubo de polietileno.
NOTA: El tejido tiempo de vida media del colorante OI utilizado (una sonda comercial con excitación a 680 nm) para medir la actividad de MMP in vivo es de 72 h. Para garantizar un juego completo, una re-inyección del colorante no se recomienda antes de 7 días después de una inyección previa.
4. imágenes ópticas
- Colocar un plástico negro o una hoja de papel en el cuadro negro de la OI-escáner en el centro del campo de visión (FOV).
- Establecer un protocolo de medición y elegir la longitud de onda adecuada (excitación: 680 ± 10 nm y correoMisión: 700 ± 10 nm) y de imagen parámetros.
NOTA: En algunos sistemas de OI, la configuración para varios colorantes de imagen es predefinido. - Para elegir el protocolo correcto para obtener imágenes de fluorescencia, abra el software de imagen (proporcionado por el fabricante) e inicializar el sistema. La mayoría de las cámaras CCD necesitan para enfriar a su temperatura de trabajo, y esto puede tomar 10 minutos. Para obtener resultados fiables, espere hasta que el sistema está listo.
- Observe el vivo de imágenes panel de control de adquisición de sistema en Pop Up y cada par filtro seleccionado representará una imagen de la secuencia. En este caso, adquirir una imagen con los pares de filtros para el colorante comercial con y una excitación y de emisión de longitud de onda de 680 ± 10 nm y 700 ± 10 nm, respectivamente, y comenzar la medición (Pulse "Adquirir secuencia"). Para obtener instrucciones más detalladas, consulte el manual del fabricante.
- Etiquetar las imágenes de manera adecuada y guardar la información en el "Editar imagenEtiquetas" ventana, que aparecerá después de la 'secuencia de Acquire'.
- Tome una exploración de referencia de cada animal antes de la inyección del colorante OI, o utilizar animales de control no tratados previamente para diferenciar la señal de fondo.
- h después de la inyección en vena de cola del colorante OI, colocar los animales en el centro del FOV, en una posición para medir la señal más alta en el sistema de OI, y empezar las mediciones.
NOTA: Importante: La hipotermia puede influir significativamente en la distribución de los agentes de imagen. Asegúrese de que la etapa se calienta hasta 37 ° C para evitar la hipotermia del animal. Imaging puede realizarse simultáneamente con los animales en grupos de 1 a 5 ratones. Seleccione el tamaño del campo de visión en función del número de animales para medir al mismo tiempo. Puede tomar una imagen de campo claro para comprobar si cada ratón es visible.
Análisis 5. Datos
NOTA: Realizar un análisis de los datos utilizando el software siguiente imagenel protocolo del fabricante.
- Para las mediciones de la AR, utilice la unidad de calibrado de la emisión de fotones como se muestra en la Figura 2, mientras que crónica CHSR se representa como intensidad de la señal en porcentaje (eficiencia).
- Para dibujar regiones de interés de forma manual, utilice la placa de herramienta. Para el análisis de las imágenes con AR utilizar un círculo estandarizada, colocado alrededor de la señal más alta de todos los tobillos y las patas de cada animal. Para analizar la CISS, colocar las regiones de interés alrededor de todo el oído derecho y el izquierdo según la imagen de campo claro.
- Para medir la emisión de fotones o señal de valores de intensidad en la ROI, pulse "medida" específica dibujada. El sistema proporcionará valores de la ROI dibujado para el análisis estadístico descriptivo.
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Representative Results
Para inducir la artritis reumatoide (RA) en ratones BALB / c ingenuos, se inyectaron ip animales con autoanticuerpos (dilución 1: 1 con 1x PBS) frente a GPI el día 0. La inflamación máxima (hinchazón de tobillo) en este suero GPI inducido El modelo RA es el día 6 después de la inyección 11 . Por lo tanto, se prepararon 2 nmol del colorante OI activable e inyectaron iv en la vena de cola de ratones artríticos y animales de control sanos al día 5. 24 h después de la inyección (día 6), se anestesiaron los ratones y se formaron imágenes como se describe en la sección 3 Figura 1A ).
Para inducir CHR, los ratones C57BL / 6 se sensibilizaron con TNCB al 5% el día 0 en el abdomen afeitado. El día 7 después de la sensibilización se inició el primer desafío en el oído derecho con 1% de TNCB. Se realizaron hasta cinco desafíos (día 15) para inducir inflamación crónica. 7 12 h después delEn el último desafío, se inyectaron iv nmol del colorante OI iv . El día 15, 24 h después de la inyección, se realizó OI como se ha descrito anteriormente ( Figura 1B ).
La Figura 2 muestra una señal de fluorescencia claramente mejorada en las patas posteriores, los tobillos y las patas delanteras del ratón RA al día 6 después de la inducción de la enfermedad, en comparación con los tobillos de control ( Figura 2A ). El análisis de biodistribución de la actividad de MMP en órganos de ratones RA y ratones sanos exhibió una señal fuertemente aumentada en las patas traseras, tobillos y patas delanteras exclusivamente en las articulaciones de ratones RA. Curiosamente, se determinó una mejor señal MMP en ambos riñones de todos los RA medidos ratones, cuando se compara con los riñones de ratones de control sanos ( Figura 2A , a la derecha). Además, hemos medido una señal mejorada MMP en el hígado y el intestino, independientemente de si los ratones sufren de AR. No se encontraron diferencias entre RA y ratones sanos en tél páncreas, pulmón, bazo y corazón.
Durante CHR crónica (cinco desafíos TNCB en el oído derecho), que mide altamente aumento de la actividad MMP en la oreja inflamada derecha en comparación con la oreja de control izquierdo sano (Figura 2B).
Por lo tanto, nuestros datos están indicando un papel importante de la actividad de MMP durante la progresión de la enfermedad en ambos modelos de enfermedades inflamatorias.
Conjuntos de herramientas para la bioluminiscencia y fluorescencia permiten la cuantificación de, por ejemplo pmol de fluorocromo o el número de células que expresan de fluorescencia. Los datos se pueden visualizar en 1. Tiempos: muestra una medición sin calibrar del incidente de fotones en la cámara, 2. Radiance (fotones): indica una medición de calibrado de la emisión de fotones en "fotones / segundo / cm 2 / estereorradián", que es recomendado para formación de imágenes de luminiscencia o 3. REficiencia adiant (fluorescencia): muestra resplandor emisión de fluorescencia por cada fuente de excitación incidente, recomendado para mediciones de fluorescencia.
Una gran ventaja de trabajar con unidades de radiancia, mientras que el análisis de imágenes OI es, que los ajustes de la cámara pueden ser cambiados durante un experimento, y esto no tiene ningún impacto en la cisterna o los datos medidos ROI imágenes, lo que permite más imágenes que comparan diferentes sistemas de IVIS.
La región de interés (ROI) indica el área específica de interés del usuario en una imagen óptica. La barra de herramientas permite dibujar 3 ROIs diferentes: medición (mide la intensidad de señal en la ROI de la imagen), el fondo promedio (medidas de la intensidad de señal media en la zona definida por el usuario para el fondo), o ROI sujeto (identifica un sujeto animal en una imagen).
Si los sujetos disReproduce una alta señal de fondo no específica, obtiene una medida de ROI corregida en segundo plano restando la señal de fondo (ROI) del ROI objetivo. Establezca el mínimo de la imagen cerca de cero para determinar la fluorescencia automática o la luminiscencia de fondo natural en su imagen. Vincule la imagen a una imagen de fondo autodefinida (específica para el usuario) que se midió principalmente con la imagen específica medida.
Los análisis semicuantitativos de las imágenes se realizaron dibujando regiones estandarizadas de interés (ROI) tanto en los tobillos artríticos como en los tobillos de control, así como en oídos inflamados y sanos utilizando el software Living Image. Sólo se realizaron análisis estadísticos descriptivos en datos in vivo en este manuscrito, debido al número insuficiente de animales. El análisis de la intensidad de la señal de los tobillos artríticos y sanos o patas mostró una intensidad de la señal de MMP 7 veces mayor en artríticos, en comparación con los tobillos de control. A 3 veces mayor intensidad de la señal MMP se detectó en las patas delanteras de los ratones artríticos en comparación con la de los animales sanos (Figura 3A).
Análisis de oídos con CHR aguda y crónica en comparación con la oreja de control sin respuesta izquierdo mostró una señal MMP aumentado significativamente incluso después del desafío 1 st, que aumentó aún más después de la 3ª y se mantuvo en el mismo nivel hasta el 5 desafío (Figura 3B) . Como consecuencia de la contaminación con el alergeno de contacto en la oreja izquierda debido a los arañazos de los ratones, se determinó una señal MMP ligeramente aumentado en la izquierda (no TNCB desafiado) oído control. Los resultados indican un papel importante de las MMPs, evidenciada por una señal de fluorescencia altamente aumentado durante GPI-artritis y la inflamación crónica, tal como se mide por OI.
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Figura 1: RA y CHR modelos, Tiempo de curso de inducción de la enfermedad y puntos de tiempo para OI. (A) Curso temporal de la inducción de la AR en ratones BALB / c (B) y la inducción CHR crónica en ratones C57BL / 6. Descripción general de la respectiva de imágenes in vivo punto de tiempo y los puntos de tiempo de inyección asociados del colorante OI para medir la actividad MMP en ambos modelos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: MMP OI en la AR, CHR y los animales control. (A) Los resultados representativos de la actividad de MMP medida en un ratón artrítico 6 días después de la inducción GPI-artritis y un ratón de control sano (lado izquierdo). Significativamente más alto de señal (Resplandor (p / s / cm 2 / sr)) intensity se observó en la artritis en comparación con el ratón sano. La imagen de la derecha muestra la actividad MMP en las patas traseras, e incluye los tobillos, patas delanteras, páncreas, pulmón, bazo, corazón, riñones, hígado y el intestino de un ratón GPI-artritis sacrificaron después de la inyección de colorante OI. OI descubrió una señal de alta en las patas delanteras, los tobillos y las patas traseras de los ratones con AR y el hígado y el intestino, independientemente de si los ratones fueron inyectados con GPI suero (ratones RA) o suero de control (ratones de control sanos). Señal de fluorescencia (B) MMP en los oídos con CHR crónica (izquierda) y animales de control (derecha). La oreja derecha inflamado (desafiado 5 veces) muestra una señal altamente reforzada en comparación con el control de las orejas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
<br /> Figura 3: Análisis cuantitativo de semi de inflamado y los tobillos sano y tejido del oído Uso de OI. (A) análisis semi-cuantitativo de la señal de fluorescencia en la AR y animales sanos en las patas delanteras y las articulaciones del tobillo. patas delanteras artríticas y las articulaciones del tobillo muestran una significativamente (** p <0,05) (n = 3) más alto de la señal MMP en comparación con las articulaciones del tobillo sanas y patas delanteras. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar. (B) El análisis semicuantitativo de la oreja derecha (desafiados) izquierda y después de la 1 st, 3º y 5º desafío. Señal de MMP aumenta significativamente desde la primera hasta la 5ª desafío y ya mostró una intensidad de señal máxima en el derecho desafiado oreja después del desafío 3 rd (** p <0,05) (n = 3) (orejas de control están contaminados en parte con TNCB debido a los ratones rascado. Esto produjo una señal mejorada que no fue significativa). Los datos se presentan como la media± SEM. Se utilizó la prueba t de Student de 2 colas para analizar las diferencias entre la inflamación (tobillos GPI-artríticas, orejas tratadas derecha) y de control (tobillos de control, a la izquierda orejas no tratadas) para ambos modelos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
OI es una herramienta muy útil, rápida y barata para la imaginería molecular in vivo no invasiva en la investigación preclínica. Una fuerza particular de OI es la capacidad de monitorear procesos altamente dinámicos como respuestas inflamatorias. Por otra parte, OI permite que uno siga el curso de una enfermedad por un período extenso de tiempo, extendiéndose de días a las semanas.
OI tiene varias ventajas sobre otras modalidades de imagen in vivo, tales como la tomografía por emisión de positrones (PET) o la resonancia magnética (MRI), ya que es muy tiempo y costo-eficiente. Es posible un análisis de alto rendimiento con hasta cinco animales por adquisición. Además, se dispone de un gran número de sondas, dirigidas a muchos procesos biológicos diferentes. 12 Para proporcionar más información anatómica, la OI puede combinarse con otras técnicas de imagen como la RM o la radiografía. Otra limitación es su baja profundidad de penetración de tejido comparada por ejemplo con fImágenes de PET no unidas. Además, se dispone de una gran cantidad de sondas que apuntan a muchos objetivos biológicos diferentes. 12
Los efectos de la anestesia no deben subestimarse en la formación de imágenes in vivo . Aunque los efectos específicos de la anestesia sobre los resultados de la OI no están bien caracterizados, nuestro grupo ha demostrado en varios estudios la influencia de la anestesia en los resultados de la imagen de PET. 13 , 14 , 15 Por ejemplo, Fuchs et al. Analizaron los parámetros sanguíneos, tales como pCO 2 , pH y lactato antes y después de PET escanea usando diferentes protocolos de respiración y anestesia. Se demostró que cambios significativos en los niveles de pCO 2 y lactato en ratones anestesiados comparados con oxígeno consciente o con respiración aérea llevaron a cambios significativos en los resultados de PET. 14 Concluyen que este efecto es causado principalmente por la respiración de oxígeno y subsecuentementeT a la acidosis respiratoria en animales, dando lugar a los diferentes resultados en la PET de imágenes.
La estandarización de los parámetros anestésicos, como las concentraciones de O 2 y las dosis de fármacos anestésicos, así como la prevención de la hipotermia ayudan a evitar fracasos sistemáticos. Por supuesto, OI está limitada por las propiedades físicas, por ejemplo, la dispersión de la luz, el tejido auto-fluorescencia y la atenuación de la luz [ 9] . Varios grupos están abordando estos problemas combinando los resultados macroscópicos de OI con otras técnicas como la microscopía de fluorescencia in vivo o citometría de flujo.
En varios modelos experimentales de inflamación como CHS, 7 se ha utilizado la formación de imágenes in vivo de actividad de MMP mediante sondas fluorescentes activables específicas de MMP, pero también en enfermedades como isquemia cerebral, 16 aneurismas aórticos, 17 infarto de miocardio 18y placas ateroscleróticas 19, así como diversos modelos de tumores. 20
Por ejemplo, Cortez-Retamozo et al. investigado la actividad in vivo de MMPs en un modelo de inflamación de las vías respiratorias alérgicas mediante la inyección de una sonda activable MMP, 24 h después de la aplicación intranasal de ovoalbúmina en ratones previamente sensibilizados. 21 para identificar la localización de la actividad MMP aún más este grupo combinado OI tomográfica, broncoscopia NIR de fibra óptica y microscopía intravital con el fin de controlar el curso de la respuesta de la enfermedad y el tratamiento en mayor detalle. 21
Otros enfoques para medir en la actividad de MMP in vivo sobre todo utilizar inhibidores de MMP que se unen al sitio activo de MMP. McIntyre et al. describieron un tumor in vivo asociada MMP-7-detección utilizando un "sustrato fluorogénico a base de polímero", que actúa como un "proteolytic beacon" para MMPs en un modelo de xenoinjerto de ratón. 22 muestran que la actividad de MMP-7 podría ser detectado selectivamente por formación de imágenes ópticas. 23 Además, Olson et al. investigó 'célula penetrante péptidos activables' (ACPPs) que son capaces de objetivo muchos modelos de tumor de xenoinjerto, pero no puede adsorber en la célula hasta que se proteolizada el enlazador. investigaron ACPPs que son selectivos para MMP-2 y MMP-9. 24, 25
Etiquetado de los inhibidores de MMP con isótopos radiactivos para la emisión de fotón único tomografía computarizada (SPECT) o formación de imágenes PET se utilizó para estudiar la expresión de MMP en la aterosclerosis 26 y el cáncer 27. En un estudio reciente un inhibidor de MMP marcado con fluorescencia se comparó con una sonda de MMP-activable. 28 El inhibidor de MMP-marcado con fluorescencia mostró una señal inferior al ruidoEn comparación con una sonda activable, pero requirió un tiempo de absorción más corto.
Los nuevos biomarcadores para evaluar las características clave de la fisiopatología pueden ser utilizados y validados por OI. Por ejemplo, la respuesta a patrones moleculares asociados al peligro (DAMPs) es un evento temprano durante una reacción inflamatoria. Vogl et al. Utilizó un anticuerpo marcado con Cy5.5 contra la alarmin S100A9 en modelos de dermatitis aguda de la piel del oído, artritis inducida por colágeno e infección con Leishmania major para desarrollar un biomarcador sensible para signos tempranos de inflamación. 29
En conclusión, OI representa un método rápido y eficiente para la investigación preclínica, que es capaz de descubrir nuevos mecanismos de enfermedades in vivo , la caracterización de nuevos objetivos moleculares, así como el seguimiento de los efectos terapéuticos . Sin embargo, podría ser necesario un proceso de validación posterior con más técnicas cuantitativas como PET.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a Daniel Bukala, Natalie Altmeyer y Funda Cay por su excelente soporte técnico. Agradecemos a Jonathan Cotton, Greg Bowden y Paul Soubiran por editar el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Werner Siemens-Fundación y la Facultad de Medicina de la Universidad Eberhard Karls de Tübingen ('' Promotionskolleg '') y por el DFG a través de la CRC 156 (proyecto C3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | - | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | - | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
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