عزل الخلايا البطانية السلف من المتطوعين الأصحاء وإمكاناتهم الكثيرة تأثر عينات المصل بعد جراحة القلب
Summary
الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) تشارك بشكل حاسم في اتساع الأوعية الدموية في الأنسجة الدماغية. يصف هذا الأسلوب عزلة EPCS الإنسان من الدم المحيطي، وكذلك التعرف على إمكانات المهاجرة ضد عينات مصل الدم من المرضى لعمليات جراحية في القلب.
Abstract
ويتم تجنيد الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) من نخاع العظام في ظل ظروف مرضية مثل نقص الأكسجة وتشارك بشكل حاسم في اتساع الأوعية الدموية في الأنسجة الدماغية. الأصل، وتصنيف وتوصيف EPCS معقدة. بالرغم من ذلك، تم إنشاء اثنين من أبرز أنواع فرعية من EPCS: ما يسمى ب "في وقت مبكر" EPCS (يشار لاحقا إلى المبكرة EPCS ع) EPCS وفي وقت متأخر من ثمرة (أواخر EPCS). ويمكن تصنيفها حسب الخصائص البيولوجية، فضلا عن ظهورها في المختبر خلال الثقافة. في حين تظهر EPCS "الأولى" في أقل من أسبوع بعد ثقافة الخلايا وحيدة النواة المشتقة من الدم الطرفية في EC-محددة وسائل الإعلام، EPCS في وقت متأخر من ثمرة يمكن العثور على بعد 2-3 أسابيع. وقد تم الاعتراف EPCS في وقت متأخر من ثمرة أن تشارك مباشرة في اتساع الأوعية الدموية، وذلك أساسا من خلال قدرتها على التمايز إلى خلايا البطانية ناضجة، في حين أن "في وقت مبكر" EPCS تعبر عن العوامل عائية المختلفة وendogenالبضائع الأوس لتعزيز الأوعية الدموية بطريقة نظير الصماوي. خلال عضلة القلب نقص التروية / ضخه (I / R)، عوامل مختلفة تتحكم صاروخ موجه من EPCS إلى مناطق تكوين الأوعية الدموية.
بلعم عامل الهجرة المثبطة (MIF) هو الموالية للالتهابات، وأعرب عن بتواجد مطلق خلوى مثل chemokine وصفت مؤخرا على العمل المنظم الرئيسي اعتبارا من الهجرة EPCS في تركيزات الفسيولوجية 1. ومن المثير للاهتمام، يتم تخزين MIF في برك داخل الخلايا ويمكن بسرعة أن تطلق في مجرى الدم بعد عدة مؤثرات (مثل احتشاء عضلة القلب).
يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل موثوقة وثقافة المبكر EPCS من البالغين الدم المحيطي البشري استنادا إلى التحديد-CD34 الإيجابي مع الثقافة اللاحقة في المتوسط تحتوي على عوامل النمو البطانية على لوحات فبرونيكتين المغلفة للاستخدام في فحوصات في المختبر الهجرة ضد عينات مصل من المرضى لعمليات جراحية في القلب. علاوة على ذلك،ويتجلى تأثير الهجرة من MIF على الكيميائي من EPCS مقارنة مع السيتوكينات تحفيز الأوعية الدموية الأخرى المعروفة.
Introduction
الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) تنتشر في دم الإنسان ولها القدرة على التمايز إلى خلايا بطانة الأوعية الدموية 2. يشاركون في تكون الأوعية وقادرون على التقليل من الأضرار الناجمة عن التهاب ونقص التروية / ضخه (I / R) إصابات بطرق مختلفة 3، 4. على سبيل المثال، EPCS تظهر مستويات مرتفعة من الانزيمات المضادة للأكسدة داخل الخلايا مثل الكاتلاز، البيروكسيديز الجلوتاثيون أو سوبر أكسيد ديسميوتاز المنغنيز (MnSOD) 5. المقاومة مرتفعة ضد الاكسدة تسمح EPCS للعمل في microenvironments مع الأنواع مرتفعة الاكسجين التفاعلية (ROS) بعد الإصابة الدماغية 6. وأشارت دراسات سابقة إلى أن عدد من EPCS قد تكون مرتبطة إلى إصلاح الأوعية الدموية وانخفاض عدد تعميم EPCS يتوقع وقوع أحداث القلب والأوعية الدموية 7،الطبقة = "XREF"> 8. ومع ذلك، لم يتم العثور على تعريف واضح لEPC حتى الان. حتى الآن، ليس هناك أية علامة سطح الخلية المحددة أو النمط الظاهري ثابت لEPCS وهذه الخلايا نادرة جدا في الدم المحيطي 9. وينبغي النظر في EPC الإنسان باعتبارها الخلية تعميم لديهم القدرة على المساهمة في إعادة بناء البطانة الجرحى والهياكل الأوعية الدموية الجديدة.
طريقة واحدة لعزل وتوصيف EPCS هي من خلال الانضمام إلى فبرونيكتين. وبالتالي، يتم استخدام قدرة هذه الخلايا لإظهار التصاق متفوقة على الفيبرونكتين أطباق المغلفة مقارنة الكولاجين من صنف 1، على سبيل المثال 3 و 10 و 11. ومع ذلك، وجد آخرون أن خلايا الطلاء وحيدات النوى على الأطباق المغلفة فبرونيكتين دون أي خطوة تنقية السابقة أو يؤدي إلى مزيد من المستعمرات بما في ذلك الخلايا الاولية الدم النخاعي، وحيدات، والخلايا اللمفية تي 12، 13، 14. وعلاوة على ذلك، في هذه الحالة، قد الصفائح الدموية تلوث الخلية وحيدة النواة (MNC) جزء، وبالتالي نقل البروتينات غشاء البلازما إلى أي خلايا ملتصقة 15.
وبالاضافة الى توصيف من خلال فحوصات في المختبر الالتصاق، يتم استخدام مزيج من مختلف علامات سطح الخلية لوصف نوع من الخلايا تعتبر الاتفاقية الأوروبية. في هذه الحالة، بعد التصاق بوساطة فبرونيكتين، والخلايا يتم تحليل بشأن سمات مثل البطانية الخاصة بهم. في هذه العملية، وهما البطانية علامات الخلايا المرتبطة، الأسيتيل-البروتين الدهني منخفض الكثافة (acLDL) وعامل النمو البطاني الوعائي مستقبلات 2 (VEGFR-2، KDR)، تلعب دورا في ذلك. وقد تبين أن الخلايا البطانية والبلاعم لاتخاذ خصيصا acLDL في عملية تسمى "طريق خلية زبال" 16. بروتين آخر علامة هو KDR كما مستقبلات عامل نمو بطانة الاوعية الرئيسي على البطانيةخلايا 17. لكن، وكما EPCS بشكل عام يتم تربيتها في وسائل الإعلام تستكمل مع عوامل النمو البطانية والجنين مصل العجل، فمن الممكن أن الضامة، والتي قد أيضا تم عزلها عن طريق الخطأ، يحمل ملف تعريف علامة تشبه البطانية. كما هو موضح سابقا، إذا مثقف في المتوسط مكيفة البطانية، الضامة تعبر عن البروتينات "، البطانية محددة" (18).
بشكل عام، هناك نوعان من EPCS ضمن أكثر أنواع فرعية، والتي يمكن أن تكون موجودة في الدم أو يكون المثقف في المختبر. تظهر في وقت متأخر من ثمرة EPCS (في وقت متأخر من EPCS) بعد 2-3 أسابيع من الثقافة. يتم دمج هذه الخلايا بشكل أسرع إلى أحادي الطبقة من الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان ويمكن أن تشكل الأنابيب الشعرية (19). الى جانب ذلك، ما يسمى ب "المبكر EPCS" تدور في الدم لمدة أسبوع واحد والتصرف بطريقة أكثر سلبية من خلال تقديم الجزيئات عائية، مثل نمو بطانة الأوعية الدمويةعامل (عامل نمو بطانة الاوعية)، أو CXCL8 19. المرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي (CAD) وجود كميات أقل بكثير من EPCS المبكرة مقارنة مع مجموعة السيطرة من دون 20 CAD. ومن المثير للاهتمام، وأظهرت نفس المجموعة كميات أكبر من وقت متأخر من EPCS مقارنة مع مجموعة السيطرة. وأظهرت دراسة أخرى أن المبكر EPCS حماية EPCS متباينة من الخلايا تحت ظروف الأكسدة بطريقة نظير الصماوي 6. لذلك، EPCS مبكرة قد توفر آثار وقائية ذات الصلة من خلال هجرة الخلايا الأخرى بطريقة صناعة السيارات في أو نظير الصماوي في الدم المحيطي.
يصف هذا البروتوكول وسيلة لتنقية EPCS المبكرة من خلال عزل لأول مرة PBMC-جزء من الدم المحيطي البشري وبالتالي عزل CD34 + الخلايا من PBMC-جزء لمسح هذا تعليق خلية من الخلايا غير المرغوبة. CD34 هو علامة، والذي يستخدم لعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الإنسان 9 </sup>. بعد ذلك، والخلايا CD34 + يتم تربيتها على الأسطح زراعة الأنسجة المغلفة فبرونيكتين. بعد ثلاثة أيام، يتم تغيير المتوسطة، وبالتالي فقدان كل الخلايا غير ملتصقة. وأخيرا، ملطخة EPCS معزولة للتحقق من امتصاص acLDL وجود KDR كما البطانية خلية علامة باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). كما علامة إضافية، قمنا بتحليل الصفائح الدموية البطانية جزيء التصاق الخلية (PECAM-1، CD31)، والذي يحدث أيضا على الخلايا البطانية.
ترميم الأنسجة عضلة القلب التالفة أو محتشية خلال تعزيز توظيف EPCS ينتمي إلى استراتيجيات العلاج التحقيق بشكل مكثف في أمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، فإن ترجمة النتائج التجريبية في الممارسة السريرية لا تزال صعبة، نظرا للتفاعل الخلوي تعقيدا في جسم الإنسان خلال مختلف الظروف المرضية. وعلاوة على ذلك، وأنا عضلة القلب / إصابات R تؤدي إلى إفراز مفرط من مختلف السيتوكينات والهرمونات والقوات المسلحة الكونغولية النمو الاختصاصات، التي تسيطر على صاروخ موجه من EPCS إلى مناطق تكوين الأوعية الدموية 13. كما هو مبين بالفعل، CXCL8، المستمدة الخلايا اللحمية عامل 1α (SDF-1α، CXCL12)، وزيادة عامل نمو بطانة الاوعية والبلاعم الهجرة عامل مثبط (MIF) بشكل كبير في عينات مصل التالية عضلة القلب I / R إصابة 1. ومن بين هذه العوامل، MIF هو مثل chemokine خلوى عديد المظاهر ذات الخصائص الغالب الموالية للالتهابات. وعلى النقيض من الاسم التاريخي لها، MIF وظائف المؤيدة للهجرة، بوصفها chemokine صحيح على مختلف أنواع الخلايا 1 و 21 و 22. وقد تم ربط عمليات تجنيد خلية MIF بوساطة لمستقبلات chemokine CXCR2 وCXCR4، الذي يربط MIF لوينشط بطريقة غير المشابهة 21. وتجدر الإشارة، EPCS تعبر عن كل من هذه المستقبلات على سطوحها، والتي أصبحت بالإضافة إلى ذلك يصل ينظم تحت ظروف نقص الأوكسجينالحمار = "XREF"> 23، 24. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة المتراكمة التي MIF له التأثير الكلي القلب واقية أثناء I / R إصابة القلب 22 و 25 و 26. وفي هذا السياق، فقد تبين أيضا أن MIF قد دعم اتساع الأوعية الدموية أثناء الإجهاد ميتة التي هي ذات أهمية خاصة، عند النظر في آليات استرداد محدودة من عضلة القلب المصاب (27). في الدراسات المختبرية والتجارب السابقة في نماذج الماوس ما قبل السريرية قدمت أول دليل حول دور MIF في EPCS توظيف 4. وتجدر الإشارة، MIF أيضا هو بروتين البضائع بارز من EPCS التي قد يتم الافراج خلال تجنيد EPCS داخل مواقع الدماغية 28. ومع ذلك، لا تزال الدراسات في المرافق الصحية ولا سيما في مقارنة مع غيرها (عائية) السيتوكينات المصل بعيد المنال.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتضمن الجزء الأول من هذه الدراسة عزل EPCS الإنسان من الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء لتمكين من إجراء تقييم شامل من دم مرضى جراحة القلب. لذلك، تم إجراء الطرد المركزي التدرج الكثافة لفصل جزء PBMC من البلازما، والمحببة وكريات الدم الحمراء. لإزالة معظم الصفائح الدموية تلو…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب ليس لديهم الاعترافات.
Materials
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
Referencias
- Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
- Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
- Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
- Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
- Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
- Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
- Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
- Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
- Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
- Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
- Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
- Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
- Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
- Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
- Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
- Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
- Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
- Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
- Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
- Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
- Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
- Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
- Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
- Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
- Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
- Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
- Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
- White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).
