Un protocolo optimizado para la maduración in vitro de ovocitos de pez cebra utilizados para la manipulación de los productos génicos maternos se presenta aquí.
eventos celulares que tienen lugar durante las primeras etapas del desarrollo embrionario de los animales son conducidos por los productos de genes derivados de la madre depositados en el oocito en desarrollo. Debido a que estos eventos se basan en productos maternas que normalmente actúan muy poco después de la fertilización, que preexisten en el interior del huevo, los enfoques estándar para la expresión y la reducción funcional que implican la inyección de reactivos en el óvulo fertilizado no suelen ser efectivas. En su lugar, estas manipulaciones deben realizarse durante la ovogénesis, antes o durante la acumulación de productos maternos. Este artículo describe en detalle un protocolo para la maduración in vitro de oocitos inmaduros de pez cebra y su posterior fertilización in vitro, produciendo embriones viables que sobreviven a la edad adulta. Este método permite la manipulación funcional de los productos maternas durante la ovogénesis, tales como la expresión de productos para el rescate fenotípico y visualización constructo etiquetado, así como unaS La reducción de la función de genes a través de agentes de genética inversa.
Durante el desarrollo animal, los depósitos madre productos génicos (por ejemplo, ARN, proteínas, y otras biomoléculas) en el huevo; estos productos son importantes para los procesos celulares tempranos inmediatamente después de la fertilización 1, 2. La manipulación de la expresión y función de los productos materna es típicamente ineficaces cuando se utiliza un enfoque estándar para la inyección de los reactivos en huevos fertilizados 3. Esto es porque la mayoría de los ARN y proteínas son producidas por el ovocito durante la ovogénesis, lo que los productos maternas precargados ya están presentes en el huevo maduro. Tales productos preexistentes son impermeables a la caída funcional, con agentes de genes de orientación, tales como oligos antisentido de morfolino (MOS), porque OMs se dirigen a los ARNm, no la proteína preexistente ya presente en el huevo en la fertilización. Además, muchos procesos embrionarios tempranos ocurren demasiado pronto después de la fertilización que se influenced por los productos de proteínas derivadas de ARN se inyecta en el huevo fertilizado, que el ARN no puede producir suficientemente rápido como para influir en los primeros eventos de la embriogénesis. Por la misma razón, etiquetado fusiones de proteínas expresadas a través de una inyección de ARNm en el óvulo fertilizado no se pueden producir en el tiempo para la visualización durante su papel activo en el embrión temprano. La inyección en ovocitos maduros extruidos antes de la activación del huevo es posible, pero se asocia con problemas técnicos similares: dichos huevos maduros se ya pre-cargado con proteína materna, y no se convertirá en traslación activo (es decir, producir la proteína de las transcripciones exógenos) hasta después de huevo activación. Por estas razones, la manipulación de los productos de los genes maternos que actúan en la embriogénesis temprana por lo general tiene que ser llevado a cabo durante la ovogénesis en el ovocito maduro.
Como un enfoque para superar estos obstáculos, es los métodos de maduración in vitro, que permiten la maduración de OOCytes de la etapa IV a la formación del huevo, se han establecido en el pez cebra. Los primeros métodos permiten la maduración in vitro, pero los huevos maduros resultantes no eran competentes para la fertilización 4. Posteriormente, la manipulación de las condiciones de cultivo de neutro a pH 9,0, imitando el pH alcalino del fluido de ovario encontrado en especies de peces 5, 6, permitido para la fertilización fiable in vitro (FIV) después de la maduración in vitro 7, 8. De hecho, en vitro ovocitos -matured pueden producir embriones viables que sobreviven a la edad adulta y que son fértiles 3, 8. Este método mejorado se ha adaptado adicionalmente para incluir la manipulación funcional de genes maternos, la expresión de proteínas etiquetadas durante la ovogénesis pez cebra través de la expresión exógena, y MO mediada funcional derribar en esteraetapa urante IV ovocitos 3 (figura 1).
Ovogénesis pez cebra presenta una serie de etapas características que conducen a la formación de ovocitos maduros 9 (véase la Tabla 1 para una guía rápida de las diversas etapas en la ovogénesis). En pocas palabras, el desarrollo de los ovocitos se inicia por los ovocitos en estadio I y está detenido en la etapa diplotena de la profase I de la meiosis. Estos ovocitos se someten a crecimiento a través de la transcripción activo (iniciado durante los estadios IA y IB), la formación de alvéolos corticales (también conocido como gránulos corticales, iniciadas durante la etapa II), y la vitelogénesis (iniciado durante la etapa III). crecimiento de los ovocitos se completa durante la etapa IV, cuando meiosis I hojas de vida, lo que resulta en el desmontaje del núcleo de ovocitos, referido como la vesícula germinal (GV). Posteriormente, la meiosis es detenido de nuevo en la metafase II. La finalización de crecimiento de los ovocitos y detención meiótica durante la etapa IV conduce a una etapa de madurez V por ejemplo,g 9. La eliminación de la membrana folicular se produce durante la liberación del ovocito en el lumen del ovario 10 y es esencial para la fertilización y la activación del huevo apropiado. Una vez que los huevos son extruidos de la madre durante el apareamiento natural, que se activan. En el pez cebra, la exposición a agua es suficiente para la activación del huevo completo, independientemente de la presencia de espermatozoides 11.
En condiciones in vitro permiten actualmente para la maduración de ovocitos de etapa temprana IV-que puede ser reconocido por su tamaño (690-730 m), la presencia de un gran GV en una posición asimétrica, y un aspecto totalmente opaco debido a la acumulación de proteínas de la yema (Figura 2B): para el huevo etapa V madura, caracterizado por un GV totalmente desmontada y una apariencia translúcida debido a la yema de procesamiento de la proteína 12 (Figura 2C). En este enfoque, los ovarios enteros contovocitos aining en diferentes etapas de desarrollo se retiran de las hembras. Los ovocitos se les permite desarrollar en 17α-20β-dihidroxi-4 pregnen-3-ona (DHP), un eficaz hormona maduración inductor de 8. Durante este período, los ovocitos de maduración se pueden manipular a través de la inyección de expresión (por ejemplo, capsulado, in vitro -transcribed mRNAs) o agentes inversa genética (por ejemplo, MOS). La capa folicular no arroja espontáneamente hacia el final del período de maduración, por lo que se debe retirar manualmente. Después de defolliculation, la fertilización in vitro se consigue mediante la activación de la activación del huevo a través de la exposición de los huevos a agua (presente en medio embrionario (E3)) 13 y una solución de esperma. Los zigotos resultantes experimentan un desarrollo embrionario y permiten la evaluación de la capacidad de los tratamientos para manipular la función del gen de la madre y para la visualización y análisis de los productos etiquetados maternas ( <strong> Figura 3).
El protocolo anterior es para la manipulación de productos génicos antes de la fertilización, lo que permite el estudio de los productos génicos maternos en el embrión de pez cebra temprano. Estudios anteriores han sido capaces de madurar los ovocitos in vitro 4; este protocolo se modificó para permitir la fertilización subsiguiente in vitro de ovocitos 8 madurado. Esto a su vez permite la inyección de reactivos para la manipulación funcional y visualización de los productos de herencia materna en el embrión temprano 3. Los embriones resultantes de este método pueden ser viables y pueden sobrevivir a convertirse en adultos fértiles. En experimentos preliminares, aproximadamente la mitad de los embriones fertilizados derivados de este procedimiento eran viables en el día 5 de desarrollo, tal como se evaluó por la inflación vejiga natatoria en esa etapa, alrededor de la mitad de los cuales se convirtió, adultos fértiles (observaciones no publicadas) sanos.
Hay un numeropasos de críticos a considerar en el protocolo. Los ovocitos en la etapa apropiada para iniciar la maduración (a principios de la etapa IV) puede ser enriquecido si la hembra se ha acoplado recientemente, pero no antes de 8 dpp. El uso de pescado que no se han apareado recientemente podría resultar en la degeneración huevos 14, que no serán sometidos a maduración. Hembras apareadas en menos de 8 días tendrán una mayoría de los huevos en la etapa III o menos, y por lo tanto, los huevos no maduran correctamente in vitro. Ovarios en las hembras que se aparearon 8 días antes tendrán una fracción óptima de los ovocitos a principios de la etapa IV. Estos pueden ser reconocidos por su opacidad y la presencia de la GV en una posición excéntrica (Figura 2B). Determinación etapa de ovocitos también puede ser ayudado por la medida del tamaño, con los ovocitos colocan en un portaobjetos de micrómetro graduado bajo un microscopio y se compararon con las directrices de estadificación estándar (Tabla 1). Sin embargo, los oocitos IV etapa temprana tienen un tamaño casi máxima en comparación con madurarovocitos (reconocidos por su relativa transparencia y la ausencia de una GV; Figura 2C) y se reconocen fácilmente, como se describió anteriormente, que evita generalmente la necesidad de una medición directa del tamaño de los ovocitos.
La maduración in vitro debe comenzar dentro de varias horas de la final del ciclo de la luz del día a la que se aclimataron los donantes de ovocitos femeninos. Ovocitos no maduran correctamente, se refleja en las tasas de fertilización pobres, si se cultivan durante el período de la mañana del ciclo de luz. La razón de la dependencia circadiano del método de la maduración de ovocitos in vitro no se entiende pero probablemente refleja sesgos circadianos subyacentes en in vivo la maduración del óvulo que implican ciclismo la expresión génica durante la ovogénesis 21. Una causa común de ovocitos que fallan a someterse éxito en la maduración in vitro, a pesar de estadificación ovocito adecuado es que el DHP ha expirado. la hormona DHP expira generalmente después de un año, y para asegurar el efectoive la maduración, el lote de trabajo debe ser sustituido dentro de 9 meses de uso.
La inyección de ovocitos es otro paso crítico cuando el propósito del método es la manipulación funcional de los productos maternas. Este procedimiento tiene requisitos que difieren de aquellos para las inyecciones estándar en el huevo fertilizado en 0-30 MPF. Un factor clave en la inyección de ovocitos es la necesidad de llevar a cabo las inyecciones en condiciones que no conducen a la activación prematura de huevo, como en medio L-15 de Leibovitz 22, 23. Porque están incrustadas en los ovarios, oocitos con vencimiento también plantean retos particulares a la inyección. El protocolo anterior sugiere primera disociar ovocitos de los ovarios y manteniendo cada disociado ovocito por separado con fórceps mientras se inyecta. Esta técnica ha funcionado bien y permite ovocitos de preclasificación en la fase adecuada con una manipulación mínima. Los métodos alternativos también pueden ser utilizados, talescomo: i) la colocación de los ovocitos en la inyección estándar artesas de agarosa 15, donde las paredes verticales del soporte de la cubeta el ovocito durante la inyección (en este método alternativo, los oocitos necesitan ser transferida a placas de inyección mientras mantienen en medio de maduración in vitro) y ii ) permitiendo que los ovocitos a permanecer unidos a la masa ovárica, que puede ser sostenido con el fórceps durante la inyección para evitar el contacto con el ovocito inyectado (en este enfoque, los oocitos deben ser disociados después de la inyección tanto para facilitar la exposición DHP y para permitir su defolliculation , sí esencial para la fertilización in vitro). A pesar de este desafío específico, los ovocitos en etapa IV puede ser penetrado fácilmente con una aguja de inyección, probablemente porque la membrana coriónica en esta etapa no está completamente desarrollado 9.
Una limitación del protocolo de maduración actual es que es condiciones de maduración in vitro que promueven el desarrollo adecuado de ovocitosno puede ser creada cuando la maduración de ovocitos se inicia en las primeras etapas de la etapa IV. Los ovocitos se convierten en competentes para responder a DHP por sometidos a maduración cuando alcanzan un diámetro de 520 micras, que se produce durante la etapa III (vitelogénesis, que corresponde a la gama de 340 a 690-m) 9. Sin embargo, el cultivo de la etapa III ovocitos resultados en oocitos que no son competentes para la fecundación 3. Sólo ovocitos cuyo cultivo in vitro se inicia en la etapa IV (Figura 2B) puede convertirse en, ovocitos etapa V maduros (Figura 2C y D). Esto puede estar relacionado con el hecho de que la etapa III es esencial para la vitelogénesis y ovocito crecimiento 9. Por lo tanto, el procedimiento de maduración de ovocitos in vitro en presentado en este artículo sólo se debe utilizar con una población de partida de la etapa IV ovocitos (B), y no con los oocitos en las etapas anteriores (etapas I – III; Figur e <strong> 2A). Por la misma razón, este procedimiento está limitado a genes que se expresan en la etapa IV o posterior. La manipulación funcional de genes cuyos productos están expresadas anteriormente puede en lugar de tener que depender de métodos genéticos (véase más adelante). Las mejoras a los métodos de cultivo in vitro de maduración pueden en el futuro permitir la iniciación de cultivo de ovocitos en etapas anteriores, ampliando así el poder del enfoque de la maduración in vitro.
Otra limitación en el método presentado es que defolliculation, que es esencial para las etapas ulteriores que implican la fertilización, es actualmente un paso limitante de la velocidad en el procedimiento. La membrana folicular es una capa transparente que rodea el ovocito en desarrollo, y la eliminación puede ser tedioso. Si esta membrana no se elimina por completo, el huevo no será plenamente activado y fertilizado. Esto se hace evidente por el hecho de que el corion para expandir y el desarrollo de irregularmente colocado, surco-como structures (pseudocleavages), típico de los embriones fertilizados 11. Métodos defolliculation enzimáticos tales como colagenasa, como se usa en Xenopus, se han intentado. Sin embargo, en nuestras manos, esta técnica no ha tenido éxito, y por lo tanto depender de defolliculation manual. Debido defolliculation manual es laborioso y consume mucho tiempo, es difícil obtener grandes lotes de huevos fertilizados después de la maduración in vitro de ovocitos. Debido a la limitación temporal impuesta por defolliculation manual, que actualmente fertilizamos unos pocos, los huevos maduros desfolicularon a la vez, en lotes pequeños de 5-10 huevos. La incorporación de defolliculation enzimática con este procedimiento aumentaría probablemente de manera significativa su rendimiento y la facilidad de uso general.
Aunque los embriones producidos después de la fertilización de ovocitos -matured in vitro pueden convertirse en adultos viables, observamos que después de la fertilización in vitro, una fracción de los embriones hacer No dividir normalmente o en el momento oportuno. Actualmente estamos seleccionando para líneas cuya propagación incluye rondas de maduración in vitro de ovocitos en, que pueden resultar en patrones más robustas de desarrollo en embriones derivados a través de este método.
El procedimiento ha permitido para el rescate claro o visualización de la localización de proteínas para un número de mutaciones 24, 25. Sin embargo, para algunos genes, la regulación de la expresión del producto puede ser crucial, por lo que los productos expresados por el ARNm inyectado puede conducir a resultados variables 26. También es importante ser consciente de todos los controles (por ejemplo, embriones inyectados con reactivos que tienen propiedades similares a los utilizados en el experimento sin embargo se prevé que no producir un efecto, como OMs de control o ARN que codifican para las proteínas inertes solamente, tales como GFP), como la variabilidad subyacente puede llevar a conclusiones incorrectas.
nt "> Un enfoque implica manipulación in vitro, seguido de la fertilización es particularmente útil en el caso de productos maternalmente depositados, donde el método estándar de la inyección de ARN, OMs, o proteína en el huevo fertilizado puede no reducir efectivamente productos ya acumulados en el huevo. otros métodos desarrollados recientemente, tales como la generación de CRISPR-mutante, también son eficaces en la generación de condiciones de mutantes de los genes expresados por vía materna 26. Sin embargo, este método requiere el crecimiento de varias generaciones de pescado. la técnica de la maduración de ovocitos in vitro permite la manipulación funcional rápida a estudiar la función de los genes expresados por vía materna, incluyendo el rescate y phenocopy de mutaciones materno-efecto, así como la expresión de ARN y proteínas en el embrión temprano.The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio y los peces personal directivo instalación Pelegrí, que jugaron un papel decisivo en la facilitación de este proyecto. El apoyo a este proyecto fue proporcionada por el NIH R56 GM065303 del NIH y 2 T32 GM007133 a ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 y 2 NIH T32 GM007133 a CCE, y los NIH RO1 GM065303 a FP
Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
CaCl2 | Sigma | C7902 | |
MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
Plastic spoon | available in most standard stores | ||
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
Ice bucket | any maker | ||
Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
Paper towels | any maker | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
Timer stop watch | any maker | ||
Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
BSA | Sigma | A2058 | |
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
gentamicin | Sigma | G1272 | |
Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
Micropipetor (1-20 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (20 – 200 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (100 – 1000 µl range) with tips | any maker | ||
Conical tubes 15ml | any maker | ||
Conical tubes 50ml | any maker | ||
plastic pipette 10 ml with bulb | any maker | ||
plastic pipette 20 ml with bulb | any maker | ||
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
Reagents for fish water: | |||
Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
Reagents for E3 medium: | |||
NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
KCl | Sigma | P5405-500G | |
CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
Fish Food: | |||
Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |