強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発
Summary
網膜の注射は、加齢黄斑変性症に対する幹細胞補充療法の臨床研究で広く適用されています。この可視化の記事でラットの目に細胞を提供する強膜によるリスクの少ない、再現性と正確に変更された網膜注入手法について述べる。
Abstract
加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) などの網膜変性疾患は、世界的な不可逆的な視力喪失の主要な原因です。AMD は、機能的にサポートおよび解剖学的神経網膜の周りを囲むセルの単分子膜は、網膜色素上皮 (RPE) 細胞の退化によって特徴付けられます。非血管新生 AMD (AMD) の現在の薬理学的治療法は、病気の進行を遅くしか新規治療戦略の特定を目的とした研究を施行したビジョンを復元できません。変性の網膜色素上皮細胞を乾燥 AMD を将来的に治療するために健康な細胞の将来性に置き換えます。AMD のための幹細胞補充療法の広範な前臨床研究は、幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜注入の技術を適用する動物モデルの網膜への移植を含みます。これらの前臨床動物研究で最も頻繁に使用されるアプローチは、針の端の直接可視化の欠乏によって困難になされる、網膜の損傷で起因できるしばしば強膜ルートを通じてです。針終了位置の直接観察が可能硝子体を通して別のアプローチがより目の組織が邪魔と手術のトラウマ高いリスクを運ぶ。我々 は正常にし一貫してラット網膜下腔網膜色素上皮細胞を提供し、過剰な網膜の損傷を避けるために定義された針の角度と深さを使用するリスクが少ないと再現性のある変更された強膜注入手法を開発しました。この方法で配信される細胞は、最低 2 ヶ月は王立外科医師 (RCS) ラットで結構効果があります以前実証されています。細胞移植のみならず小分子や遺伝子治療の配信、この手法を使用することができます。
Introduction
人間の網膜は光感覚組織として目関数の後ろに位置し、視覚認知に重要な役割を果たしています。網膜細胞の機能不全や細胞死したがってビジョンの問題や永久的な盲目を引き起こします。変性や網膜の異なる層の細胞の機能不全を伴う疾患はその中で AMD は最も一般的なタイプとの先進国で高齢者に回復不能な失明の主要な原因、網膜変性疾患として知られています。1,2。AMD の病理学的プロセスが網膜色素上皮層と順番視細胞の生理学、神経網膜の萎縮およびビジョンの損失3につながるの RPE サポートを損なう基になるブルッフ膜の間「ドルーゼン」蓄積関連付け 4,5。これまでの治療がない高度な (非血管新生) AMD を乾燥します。幹細胞療法として再生医療の新しいパラダイムの出現は、健康な細胞の幹細胞の機能不全や死者の網膜色素上皮細胞を交換の希望をもたらします。確かに、広範な臨床研究移植の幹細胞 (例えば、ヒト胚性幹細胞)-RPE 変性動物モデルに派生の網膜色素上皮細胞が実行6、7にいくつかの進歩をされています。臨床試験8,9 (NCT01344993、ClinicalTrials.gov)。最近では、幹細胞が人間の網膜色素上皮層、人間の網膜色素上皮幹細胞 (hRPESCs) の居住者の代替ソース研究室によって識別され、現在 amd hRPESC 派生した網膜色素上皮細胞 (RPE-hRPESC) 移植療法の臨床研究で使用されて10,11,12,13。
網膜下注入の技術は、上記当社グループを含む複数のグループによる前臨床試験に適用されます。動物の網膜注入の 2 つの一般的なアプローチ: トランス vitreal と強膜。トランス vitreal 方法の利点はレンズに全体 vitreal 腔を越える前眼に浸透、浸透、subretinal に到達する目に後ろに網膜と針の端を直接観察することが外科医のスペース14,,1516。ただし、それは (前部と後部)、2 つの場所で網膜を中断すること、レンズを傷つけるリスクを運ぶし、針が取り消されるとき硝子体に細胞の逆流の可能性があります必要があります。対照的に、トランス強膜方法は、原則として、網膜と硝子体の関与を回避し、逆流が目を終了します。色素性の齧歯動物の外科医は当初、強膜の浸透を観察できるが、色素性の脈絡膜に通過後針の端が表示されなくなります。直接観察することがなく網膜に違反は一般的と網膜剥離、硝子体に細胞や血液の配信になります。また、眼の表面が湾曲しているために、強膜注射のため最も効果的などの針の角度と深さを知ることは非常に困難です。
この可視化の記事で光コヒーレンストモグラフィ (OCT)、注射部位の詳細な検査ができると手術後の評価を使用して通知強膜網膜注入法を紹介します。私たちの強膜注入法は、定義済みの場所、角度、および非常に低い外科的外傷と高信頼性を生成する注射針の深さを利用しています。ここでは、人間の AMD の前臨床モデル RCS ラットの網膜注入 hRPESC 網膜色素上皮細胞を具体的に示す.この注入法で正常にかつ一貫して救わ hRPESC 網膜色素上皮細胞に非常に高い成功率で RCS ラットの目の網膜。細胞の注射以前が認め RCS 視細胞の保全に注入13後少なくとも 2 ヶ月。この手順は、解剖顕微鏡の下で行われ、学ぶことは簡単です。(外科医と助手) 注射を実行する二人必要で、それぞれの動物の注入の平均時間は 5 分未満。定義された角度と注射針の深さは 10 月が正常網膜注入を達成するために利用可能な研究所を可能にします。それは再現性の高い網膜にアクセスできます、細胞移植のみならず、医薬品配送と遺伝子治療のために使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この資料に示されている網膜注入法はインジェクター針が神経網膜を傷つけるまたは硝子体腔を乱すことがなく目の壁の外側の層 (強膜・脈絡膜・網膜色素複合体) を貫通強膜の経路です。代替トランス vitreal アプローチには、レンズの損傷を齧歯動物のレンズが硝子体腔の大半を占めているので、白内障につながるの潜在的なリスクがあります。このメソッドと比較して、本手法はリスクが…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は RPE 細胞の準備のため手術とスーザン ボーデンに彼女の援助のためのパテ レダーマンを感謝したいです。我々 はまた、このプロジェクトのための資金の NYSTEM C028504 を認めます。ジャスティン D. ミラーは NIH によってサポートされて F32EY025931 を付与します。
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
Referencias
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