Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması
Summary
Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.
Abstract
Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.
Introduction
Memeli Çentik sinyal yolu, Drosophila melanogaster, aynı yol homolog olan dört transmembran Çentik reseptörleri (Notch1-4) ve sivri (JAG1 ve JAG2) Delta-benzeri (DLL1, 3 beş zara bağlı ligand içerir ve 4) aileleri 1. Bir alıcı hücreye Çentik alıcısı bir iletim hücresi 2 ligandı ile bağlı olduğunda, Çentik sinyal başlatılır. Bu şekilde trans-aktivasyon sırasında zara bağlı Çentik ligand zara bağlı Çentik alıcısı 3, 4 üzerinde bir germe kuvveti üretir. bağlayıcı ligandın germe kuvveti presenilin-içeren y-sekretaz kompleksi (γ-sekretaz) tarafından aracılık edilen bir hücreiçi bölünme etkinliği ve ardından enzim (TACE), dönüştürücü TNFalfa ile reseptörünün hücre dışı ayrılmasını kolaylaştıran Çentik reseptörde konformasyonel değişikliklere neden olur. γ-sekretaz bültenleri Notch intBu CBF-1-Su (lH) -Lag-1 (CSL), beyni benzeri (MAML) bir transkripsiyonel aktivasyon kompleks oluşturan çekirdek içine geçiş yapar ve hücre tipine spesifik faktörler, ekspresyonu hızlandırmak için racellular alan (NiCd) genler 5 hedef.
In vitro Notch yolu aktivasyonu eşsiz yöntemlere ihtiyaç Notch sinyal aktivasyon sonucu mekanik elemanlar. Eriyebilir Çentik ligandlarmın reseptörlerine Notch bağlanan, ancak aynı zamanda, rekabetçi, hücreye birleşik Çentik ligandların bağlanmasını inhibe ederken NICD serbest bırakılması için gerekli kuvvetleri gerilme özelliklerine göre başarısız olabilir. Bu nedenle, kültür ortamına eriyebilir Çentik ligandlarmın eklenmesi 6, 7 sinyal, normal Notch azaltabilir. Bunlar uygun bir şekilde katı bir alt-tabaka 5, 8, 9 sabitlenmektedir Neyse ki, Çentik ligandları NICD salınmasını,10. Ligand kaplı kültür yüzeylerde hücreleri tohumlama veya hücrelere ligand kaplı boncuklar uygulayarak hem Notch sinyali etkinleştirmek ve aralarındaki seçim Notch stimülasyon istenen zamanlaması öncelikle bağlıdır olabilir. fonksiyonel ya da farklılaşma deneyinde orta noktası boyunca arzulanan gibi anında geçici Çentik sinyal aktivasyonu için, Çentik ligand kültürlenmiş hücrelere uygulanan boncuklar, agaroz bağlı olabilir ve herhangi bir zamanda yıkanmıştır. bir kültür süresinin başlangıcından itibaren daha sürekli Çentik sinyallemesinin için, doku kültürü plakaları Hücre Serpilmesi önce bir ligant ile kaplanabilir.
Bu protokol amaçları için, yöntemler, fare osteoklast öncüler kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak burada tarif edilen yöntemler ile ilgili yöntemler ve varyasyonların hücre tipleri 6, 11, 12, 13, çok çeşitli uygulanabilir, </sup> 14. Osteoklastlar terminal kemik dokusunun emilmesinden sorumlu olan farklılaşmış hematopoietik nesilli hücreleridir ve bunlar kemik kaybı 15 birden fazla rahatsızlığa rol oynar. Böylece, monosit / makrofaj-soy öncüleri osteoklastlar ve fonksiyon osteoklastlar ve yeni kemik-yenileyici tedavilerin geliştirilmesi daha iyi anlaşılması için gereklidir kontrol eden moleküler mekanizmaların farklılaşma in vitro çalışmada. Bu artık, genel olarak bu çentik sinyal osteoklast farklılaşması ve fonksiyonunda pozitif bir rol oynadığını kabul edilmekle birlikte, her iki çentik sinyal uyarılması ve osteoklast ön-kültürü ve farklılaşmasında varyasyonlar ilk çelişkili sonuçlar 16, 17, 18, 19 yol açmıştır. Yakından yöntemleri farklılıkların incelenmesi ve genetik kullanımımodeller büyük ölçüde osteoklastogenez Notch sinyalizasyon rolünü açıklık, ama standardize Notch uyarılması ve kültür yöntemlerinin uygulama diğer hücre tipleri 20, 21, 22, 23 Notch sinyalizasyon gelecekteki çalışmalarda bu tür tartışmaları engelleyebilir.
Notch sinyali teşvik etmek için çeşitli yöntemler olduğu gibi, en iyi yöntem deneysel soru bağlı olacaktır, orada kültüre ve fare osteoklast öncülerini ayırt etmek için birden çok yöntem vardır ve. Burada, fare uzun kemiklerde temizlendi ilik hücrelerinin yapışık ve yapışmaz kesirler kültüre bizim tercih edilen yöntem sunulacaktır. Bu yöntem, farklılaşma çeşitli yöntemler uygulanabilir hücreleri esas olarak herhangi bir özel ekipman gerektiren ve üretme avantajına sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
protokolü içinde kritik adımlar
Kültür ve osteoklast ön-maddeleri arasında nitro farklılaşmasında osteoclastogenez ve kemik rejenerasyonu ve kemik kütlesinin korunması için terapötik hedeflerin tanımlanması moleküler mekanizmalarının incelenmesi için yararlı bir platform sağlar. Fare osteoklast öncülerini kültürlerken, en kritik unsur, bir naif bir durumda öncüleri bakımıdır. makrofaj-benzeri hücreler olarak, osteoklast ön-maddeleri, bakteriyel bileşen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), a grant from the AO Foundation (S-16-12A), the Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center, and an intramural orthopaedic surgery departmental research development fund. JWA is supported by the University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) fellowship funded by the National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).
Materials
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
Referencias
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it?. Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
