Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Summary

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Abstract

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Introduction

Mitochondriale Bioenergetik und Atemkapazitäten können in permeabilisierten Zellen oder Fasern nicht nur untersucht werden, sondern auch in isolierten Mitochondrien. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll intakten Skelettmuskel Mitochondrien mit differenzieller Zentrifugation für hochauflösende Respirometrie Messungen zu isolieren.

Zur Isolierung intakte Mitochondrien für Respirometrie wird das Gewebe homogenisiert und Mitochondrien werden durch ein herkömmliches Verfahren isoliert differentielle Zentrifugation. Die differentielle Zentrifugation Methode basiert auf sequenzielle Zentrifugationen basiert (in einer Reihe von zunehmenden Geschwindigkeit) von Gewebe – Homogenate wurde durch Pallade und Mitarbeiter zuerst eingeführt fast 70 Jahre vor ^1. Das Gewebe wird zunächst mit einer Schere zerkleinert und mechanisch in einem Glas-Homogenisator mit einem locker sitzende Stößel homogenisiert. Danach wird das Homogenisat bei niedriger Geschwindigkeit und das resultierende Pellet zentrifugiert, das ununterbrochene Gewebe enthält, zelluläreTrümmer und Kerne wird verworfen. Dann wird der Überstand mehrmals mit hoher Geschwindigkeit und die mitochondriale angereicherte Fraktion wird gesammelt zentrifugiert. Die Vorteile der differentiellen Zentrifugationsverfahren zu isolieren Mitochondrien sind, dass: i) das Verfahren ist schnell und Mitochondrien innerhalb 1-1,5 h (respiratorische Experimenten isoliert werden sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden); ii) es ist preiswert; und iii) es ist sehr leistungsfähig und die durch differentielle Zentrifugation erhalten Mitochondrien sind rein genug für Respirometrie Assays. Die Nachteile der differentielle Zentrifugation Methode zur Isolierung Mitochondrien sind, dass i) die Mitochondrien beschädigt werden könnte und abgekoppelt während der Homogenisierung; ii) die Verunreinigung der Mitochondrien mit anderen zellulären Komponenten (könnte die mitochondriale Pellet mit weiteren Zentrifugationsschritte) durch weiteres Waschen gelöst werden; iii) die Möglichkeit , verschiedene mitochondriale Subpopulationen von der Auswahl, zum Beispiel während einer differenziellen Zentrifugationen Schritte, mitochondria mit niedriger Dichte kann ⁷ ausgeschlossen werden; und iv) die mitochondriale Zell umgebenden fehlt und nur die theoretische maximale Atmung gemessen werden. Ein weiteres Verfahren zur Isolierung Mitochondrien für Respirometrie Assays ist die Dichtegradientenzentrifugation ^2. Bei dieser Technik wird der Gewebeextrakt über eine Lösung von Sucrose oder einem Percoll-Gradienten überlagert (mit höherer Dichte auf dem Boden des Zentrifugenröhrchen) und mit einer bestimmten Geschwindigkeit zentrifugiert, die Mitochondrien verursacht von anderen zellulären Bestandteilen isoliert werden entsprechend ihrer Dichten. Diese Methode wird häufig verwendet, Gehirn Mitochondrien aus Synaptosomen mit sehr geringer Kontamination zu isolieren. Jedoch werden die Rattenleber – Mitochondrien isoliert durch Dichtegradienten-Zentrifugation mit anderen Zellorganellen ³ stark verunreinigt. Eine der Beschränkungen dieses Verfahrens besteht darin, daß die vorliegende Sucrosegradienten in dem Zentrifugationsröhrchen bersten könnte somich Mitochondrien (osmotischer Schock).

Je nach der Art des Gewebes; gibt es einige wichtige Faktoren für die Isolierung von intakten Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation zu betrachten. Die erste Notwendigkeit ist Gewebe auf sanfte Weise zu homogenisieren. Weiches Gewebe wie Niere, Gehirn und Leber erfordern sanfte mechanische Kräfte während der Homogenisierung angewendet. Dies steht im Gegensatz zu Hartgewebe wie Herz- und Skelettmuskel, die viel stärkere mechanische Kräfte erfordern. Das zerkleinerte Gewebe wird in der Regel mit Proteinase vor der Homogenisierung behandelt, um das Gewebe zu erweichen. Alle Puffer während der Homogenisierung und Zentrifugation verwendet werden , sollten mit Cytosol mit einer ionischen und osmotische Stärke kompatibel einen physiologisch relevanten pH eiskalt sein und haben ^{4, 5.}

Einer der Vorteile von isolierten mitochondrialen bioenergetischen studieren ist, dass zelluläre Plasmamembranen brauchen nicht permeabi seinlized mit Detergenzien wie Saponin Digitonin oder ^{4, 6,} die den mitochondrialen Außenmembran Integrität beeinträchtigen könnten. Ein weiterer Vorteil der isolierten Mitochondrien ist das Fehlen von anderen cytosolische Faktoren, die mit der Analyse des mitochondrialen Funktionen wie Sauerstoffverbrauch stören können. Die Nachteile der isolierten Mitochondrien verwenden , sind die mögliche Auswahl bestimmter mitochondrialer Populationen während der Zentrifugationsschritte, Schäden an den Mitochondrien während der Homogenisierung und die Voraussetzung für die hohe Mengen an biologischen Proben , um eine gute Ausbeute an isolierten Mitochondrien ^{7, 8} zu erhalten.

Nach dem Isolierungsverfahren, die Atemfrequenz der mitochondrialen Komplexe I-, II- und IV-abhängige (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie ermittelt. Für komplexe I-driven Atmung, Glutamatund Malat werden zugegeben, gefolgt von Adenosindiphosphat (ADP), gefolgt. Für komplexe II-driven Atmung wird Succinat zugegeben, gefolgt von ADP gefolgt. Für komplexe IV gesteuerte Atmung, Ascorbat und tetramethylphenylendiamine (TMPD) zugegeben , gefolgt von ADP ^{9, 10, 11, 12.} Zustand 2 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart von Substraten allein. Zustand 3 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von Substraten und ADP. Zustand 4 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch nach der ADP Verarmungs. Die Atemkontrolle Verhältnis (RCR) ist ein Index der Kopplung von ATP – Produktion Sauerstoffverbrauch und wird als das Verhältnis zwischen dem Zustand 3 und Zustand 4 ^{13 berechnet, 15.}

Zusammenfassend beschreiben wir ein Protokoll funktionale und intakte Skelett-Muskel Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation zu isolieren und verwenden diese isoliert mitochondria für funktionelle und bioenergetischen Studien wie hochauflösenden Respirometrie.

Protocol

Die Quadrizeps Muskelbiopsie aus einem narkotisierten Schwein genommen, aus denen Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation isoliert werden. Das Schwein wird danach für ein anderes Experiment verwendet. Die Studie wird in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und mit Zustimmung des Animal Care Committee des Kantons Bern, Schweiz durchgeführt. 1. Skelettmuskel Homogenisieren und Mitochondriale Isolation …

Representative Results

Komplexe I-abhängige Atmung Isolierte mitochondrialer Komplex I abhängigen Atemfrequenzen (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie bestimmt (Abbildung 1 ist ein repräsentatives Diagramm). Mitochondriale Komplex I Substrate, Glutamat und Malat, werden durch die Zugabe von ADP zugegeben. Zustand 2 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart der Substrate allein….

Discussion

In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll hoher Qualität, intakt und eng gekoppelten Skelettmuskel Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation isoliert werden, die für funktionelle Studien wie hochauflösenden Respirometrie verwendet werden kann.

Um intakt und eng gekoppelten Mitochondrien zu isolieren, gibt es einige kritische Punkte im Rahmen der vorliegenden Protokoll berücksichtigt werden. Nach dem Skelettgewebe Ernte, sollte es sofort in eiskaltem mitochondrialen…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
ATP	Sigma	A 7699	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
EGTA	fluka	3779	Chemical
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)	Merck	1.06129	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial	Sigma	P 8038	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Tissue homogenizer
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical