Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

Resumen

Aquí, se toma una muestra de músculo cuádriceps de un cerdo anestesiado y se aíslan las mitocondrias por centrifugación diferencial. A continuación, se determinan las frecuencias respiratorias de los complejos de cadenas respiratorias mitocondriales I, II y IV mediante respirometría de alta resolución.

Resumen

Las mitocondrias están involucradas en el metabolismo energético celular y utilizan el oxígeno para producir energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP). La centrifugación diferencial a baja y alta velocidad se usa comúnmente para aislar mitocondrias de tejidos y células cultivadas. Las fracciones mitocondriales brutas obtenidas por centrifugación diferencial se utilizan para las mediciones de la respirometría. La técnica de centrifugación diferencial se basa en la separación de orgánulos según su tamaño y velocidad de sedimentación. El aislamiento de las mitocondrias se realiza inmediatamente después de la recolección de tejidos. El tejido se sumerge en un medio de homogeneización helado, se pica con tijeras y se homogeneiza en un homogeneizador de vidrio con un mortero holgado. La técnica de centrifugación diferencial es eficiente, rápida y económica y las mitocondrias obtenidas por centrifugación diferencial son lo suficientemente puras para los ensayos de respirometría. Algunas de las limitaciones y desventajas de las mitocondrias aisladas, basadas en la centrifugación diferencial, son que las mitocondrias pueden dañarse durante el procedimiento de homogeneización y aislamiento y que se requieren grandes cantidades de biopsia de tejido o células cultivadas para el aislamiento mitocondrial.

Introducción

bioenergética mitocondrial y capacidades respiratorias pueden ser estudiados no sólo en las células permeabilizadas o fibras, sino también en las mitocondrias aisladas. En el presente estudio, se describe un protocolo para aislar las mitocondrias del músculo esquelético intactas utilizando centrifugación diferencial para las mediciones de respirometría de alta resolución.

Para aislar las mitocondrias intactas para respirometría, el tejido se homogeneiza y mitocondrias están aislados por un método de centrifugación diferencial convencional. El método de centrifugación diferencial se basa en centrifugaciones secuenciales (en una serie de au....

Protocolo

La biopsia del músculo cuádriceps se ha tomado de un cerdo anestesiado, a partir del cual las mitocondrias se aíslan mediante centrifugación diferencial. El cerdo se utiliza después para otro experimento. El estudio se realizó de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el cuidado y uso de animales de experimentación y con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales del cantón de Berna, Suiza.

1. La homogeneización del músculo esquelético y aislamiento mitocondrial

1. Impuestos Especiales 5-10 g de muestras de músculo cuadriceps de un cerdo anestesiado. En el presente ensayo, utilizar el músculo ....

Resultados

Complejo I-dependiente de la respiración

Aislado tasas mitocondriales complejos I dependiente de las vías respiratorias (estados 2, 3 y 4) se determinan usando respirometría de alta resolución (Figura 1, un diagrama representativo). sustratos complejo I mitocondrial, glutamato y malato, se añaden seguidos por la adición de ADP. Estado 2 se refiere a consumo de oxígeno en presencia de los sustr.......

Discusión

En el presente estudio se describe un protocolo para aislar de alta calidad, intactos y bien acoplados mitocondrias de músculo esquelético por centrifugación diferencial que pueden ser utilizados para estudios funcionales tales como de alta resolución respirometría.

Con el fin de aislar las mitocondrias intactas y bien acoplados, hay algunos puntos críticos que deben ser considerados en el presente protocolo. Después de cosechar el tejido esquelético, debe ser sumergido inmediatamente en tam.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ADP	Sigma	A 4386	Químico
Antimicina A	Sigma	A 8674	Químico, disuelto en etanol
Ascorbato	Merck	1.00127	Químico
ATP	Sigma	A 7699	Químico
BSA	Sigma	A 6003	Químico
EGTA	fluka	3779	Químico
Glutamato	Sigma,G	1626	Químico
Hepes	Sigma	H 7523	Químico
KCl	Merck	1.04936	Químico
KH2PO4	Merck	1.04873	Químico
K-lactobionato	Sigma	L 2398	Químico
MgCl2	Sigma	M 9272
Ácido sulfónico de morfolinopropano químico (MOPS)	Merck	1.06129	Núcleo químico
de O2k: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	Instrumento de respirometría de alta resolución
Proteinasa bacteriana		Sigma P 8038	Químico
Azida sódica	Sigma	S2002	Químico
Rotenona	Sigma	R 8875	Químico, disuelto en etanol
Succinato	Sigma	S 2378	Químico
Schuett homogen-plus homogeneizador semiautomático	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Homogeneizador de tejidos
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical