Modellazione Comportamento Ovarian Cancer multicellulare Spheroid in un Microdevice dinamica 3D peritoneale
Summary
Per studiare la progressione del tumore ovarico in un modello fisiologicamente rilevanti, sferoidi multicellulari sono state coltivate in un Microdevice sotto flusso del fluido simulato. Questo modello 3D dinamica emula l'ambiente intraperitoneale con i componenti cellulari e meccanici in cui si verifica metastasi del cancro ovarico.
Abstract
Il cancro ovarico è caratterizzata da ampie metastasi peritoneale, con sfere tumorali che si trovano comunemente nei ascite maligna. Questo è associata a esiti clinici povere e attualmente manca un trattamento efficace. Sia il tridimensionale (3D) ambiente e le forze meccaniche dinamiche sono fattori molto importanti in questa cascata metastatica. Tuttavia, colture cellulari tradizionali non riescono a ricapitolare questo microambiente tumorale naturale. Così, in vivo -come modelli in grado di emulare l'ambiente intraperitoneale sono di evidente importanza. In questo studio, una nuova piattaforma microfluidica del peritoneo è stato istituito per simulare la situazione di sferoidi cancro ovarico nella cavità peritoneale durante metastasi. sferoidi cancro ovarico generati in una condizione non-aderenti sono state coltivate in canali microfluidica rivestite con cellule mesoteliali peritoneali sottoposte a fisiologicamente rilevanti sforzo di taglio. In sintesi, questa dinamica 3D ovarico mic cancro-mesoteliopiattaforma rofluidic in grado di fornire nuove conoscenze sulla biologia del cancro di base e fungere da piattaforma per lo screening di droga potenziale e lo sviluppo.
Introduction
Il cancro ovarico è il cancro ginecologico più letale ed è caratterizzata da un'ampia diffusione peritoneale e la formazione di ascite maligna 1. Questo ampio metastasi peritoneale rappresenta una grande sfida clinica ed è associata a esiti clinici povere. Diversamente dalla maggior parte dei carcinomi solidi che metastatizzano attraverso il sangue, il cancro ovarico diffonde in primo luogo all'interno della cavità peritoneale. Le cellule tumorali esistono come multicellulari aggregati / sferoidi durante il processo di metastasi 2. Il fatto che la cultura sospensione può arricchire / cellule tumorali ovariche avvio staminali tumorali suggerisce inoltre che questi sferoidi possono essere associati sia con aggressività del tumore e migliorato chemoresistance 3, 4. Ci sono differenze nella risposta ai farmaci tra le culture 2D e 3D, che hanno presumibilmente diversi meccanismi molecolari 5.
_content "> L'interazione essenziale con mesotelio costruisce il microambiente primario per la progressione del tumore ovarico. Queste cellule mesoteliali trovano su una matrice extracellulare (ECM), dove fibronectina è un costituente ubiquitario. Un collegamento tra l'aumentata espressione di mesothelial fibronectina derivato dalle cellule e è stato dimostrato progressione tumorale. fibronectina è abbondantemente presente in ascite maligna 6, 7. cellule tumorali ovariche sono anche in grado di indurre la secrezione di fibronectina dalle cellule mesoteliali per promuovere precoce ovarico metastasi del cancro 8.Prove emergenti mostra che stimoli meccanici, compresi sollecitazione di taglio, possono modulare la morfologia cellulare, l'espressione genica, e, pertanto, i fenotipi di cellule tumorali 9, 10, 11. Come ascite maligna sviluppare e accumulare durante tumor progressione, cellule tumorali ovariche sono esposti al flusso del fluido e la conseguente sollecitazione di taglio. Un certo numero di gruppi, la nostra compresa, hanno dimostrato l'impatto dello stress di taglio sulla progressione del cancro ovarico, comprese le modifiche del citoscheletro, epiteliali-to-mesenchimali transizioni ed stemness cancro 12, 13, 14, 15. Così, un microambiente fisiologicamente rilevanti è importante per la ricerca di tumore metastasi peritoneale. Tuttavia, gli attuali sistemi di coltura in vitro idrodinamici hanno limitazioni mimando e controllo di una costante, basso, fisiologicamente rilevante sforzo di taglio 16, 17, 18, 19. Convenzionale in vitro si avvicina a concentrarsi su entrambi l'ambiente cellulare o meccanico sono ancora limitati insimulando la complessità del microambiente intraperitoneale con adeguata rilevanza fisiologica.
Qui, al fine di progettare un nuovo modello del peritoneo di superare i limiti di strategie convenzionali e per avanzare lo studio del vano intraperitoneale in metastasi del cancro, una piattaforma microfluidica basata 3D con flusso del fluido controllato creata. In questo modello, sferoidi cancro ovarico sono stati co-coltura con cellule umane mesoteliali peritoneali primari in chip microfluidici sotto flusso fluido continuo (Figura 1A). Le cellule mesoteliali sono state seminate su fibronectina. Non aderenti sferoidi carcinoma ovarico sono state seminate in canali microfluidica con medie flusso continuo perfuso da una pompa a siringa. Sia l'ambiente 3D e le forze meccaniche dinamiche sono fattori molto importanti della cascata metastatica. Questa piattaforma può essere utilizzata per studiare la microambiente intraperitoneale in termini di cel complessolular e co-coltura interazioni, nonché in relazione agli stimoli meccanici dinamici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo saggio offre un modello flessibile e fisiologicamente rilevanti che possono essere incorporati con vari saggi biochimici e basati su celle, tra cui, ma non limitato a, saggi di adesione, saggi di liquidazione mesoteliali, e lo screening di stupefacenti. Esso può essere applicato alla valutazione dell'effetto del microambiente intraperitoneale sulla progressione del cancro. Tuttavia, potrebbe essere necessario ottimizzare diverse condizioni sperimentali, a seconda degli obiettivi del progetto (ad esempio,…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da Hong Kong Research Council Grant (borse di 17.122.014, C1013-15G, 719813E, e 17.304.514). AST Wong è un destinatario del Croucher Senior Research Fellowship.
Materials
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
Referencias
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