Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Summary

Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige und zeitsparendes Protokoll zu chemisch fixieren Primaten Hirngewebe mit Acrolein Fixiermittel, so dass für die Langzeitarchivierung, die kompatibel mit vorge Einbettung Immunhistochemie für die Transmissionselektronenmikroskopie.

Abstract

Trotz aller technologischen Fortschritte bei der Lichtmikroskopie Niveau bleibt Elektronenmikroskopie das einzige Werkzeug in den Neurowissenschaften zu untersuchen und zu charakterisieren, ultrastrukturelle und morphologische Details von Neuronen, wie synaptische Kontakte. Gute Erhaltung von Hirngewebe für die Elektronenmikroskopie kann durch strenge Kryo-Fixierung Verfahren erhalten werden, aber diese Techniken sind ziemlich teuer und begrenzen die Verwendung von Immunmarkierung, die von entscheidender Bedeutung ist, um die Konnektivität von identifizierten neuronalen Systemen zu verstehen. Gefriersubstitution Verfahren wurden die Verbindung von Kryo-Fixierung mit Immunmarkierung zu ermöglichen, entwickelt. Allerdings stützt sich die Reproduzierbarkeit dieser methodischen Ansätze in der Regel auf teure Gefriergeräte. Darüber hinaus wird mit dieser Technik zuverlässige Ergebnisse zu erzielen ist sehr zeitraubend und Geschick schwer. Somit bleibt das traditionelle chemisch fixierte Gehirn, insbesondere Acrolein Fixiermittel, eine zeiteffiziente und kostengünstige Methode Elektron zu kombinierenMikroskopie mit Immunhistochemie. Hier bieten wir ein zuverlässiges experimentelles Protokoll unter Verwendung von chemischen Acrolein Fixierung, die zur Erhaltung der Primaten Hirngewebe führt und ist kompatibel mit Pre-Einbettung Immunhistochemie und Transmissions-Elektronen-mikroskopische Untersuchung.

Introduction

Lichtmikroskopie, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen – Mikroskopie, hat sich als ein wirksames Instrument zur in vivo neuronalen Prozesse zu studieren, unter anderem ^{1, 2.} Obwohl die typische räumliche Auflösung bei der Lichtmikroskopische (LM) Ebene ungefähr 200 nm, die jüngsten technologische Fortschritte sind verschiedene Lichtquellen, wie beispielsweise extremer Ultraviolett- und weiche Röntgenmikroskopie, hat insbesondere diese Auflösung auf eine fast 10 nm räumlichen Auflösung erhöht ^{3 , 4, 5.} Weitere technologische Fortschritte in der bildgebenden Magnetresonanz – Bildgebung umfassen mit der Histologie kombiniert und bieten ein neues Verfahren zur in vivo , die Dicke der Myelinscheide Messen eines Parameters, der traditionell meßbaren nur an der Elektronenmikroskopische (EM) Stufe ^{6, 7} war. Although diese Fortschritte bei der LM-Ebene ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung lebende Prozesse liefern, um eine Detailansicht und Charakterisierung von Strukturen, wie synaptische Kontakte kann nur mit EM erreicht werden, die eine Auflösung bietet, die 0,5 nm erreichen kann. Allerdings Beobachtung bei der EM-Ebene erfordert die Proben in gewisser Weise tot und verändert zu werden, mit chemischen Fixateure und Entwässerungsverfahren, um die Zytoarchitektur zu bewahren. Somit können biologische Proben bei hoher Auflösung der Prüfung herausfordernd aufgrund von Strahlungsschäden des Elektronenstrahls, geringem Kontrast, strukturelle Abweichungen von Membranen oder auch das Vorhandensein von Artefakten , die nach der Dehydratisierung und epoxy auftreten können Einbettung ^{8, 9, 10.}

Die Erhaltung Proben in ihrer nativen Form für die Strukturanalyse kann mit „Cryo EM verglastem Sections“ oder CEMOVIS, mit schneidendem Ansatz erreicht werden, dassbeinhaltet schnell einfrieren und die Probe in Eis glasiger Einbettungs und die Abschnitte unter der EM bei einer kryogenen Temperatur ^{11, 12} zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Proben , während sie noch fester und vollhydratisierte sind, so dass Artefakte , die durch Austrocknung Beseitigung verarbeitet ^13. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren zusätzliche Vorrichtungen für Kryo-Ultramikrotomie, sowie zusätzliche Geräte auf dem Standard-EM, um diese Beobachtung bei sehr niedrigen Temperaturen zu ermöglichen, was erhebliche Mehrkosten erzeugen. Darüber hinaus schließt die CEMOVIS Ansatz die Verwendung von Techniken Immunmarkierung, da Antikörper in der Regel bei RT inkubiert werden müssen. Alternativ ist es möglich, ultrastrukturelle Analyse mit immunhistochemischen Verfahren zu kombinieren, indem eine Gefriert Substitution Ansatz, bei dem Kryo-fixierten Proben langsam aufgetaut werden, während in Cryo-Schutzchemikalien immerged und sind then in Spezialharze eingebettet, wie Lowicryls. Post-Einbettung Immunmarkierung kann dann auf einem solchen Material ¹² durchgeführt werden. Allerdings Gefriersubstitution und Kryo-Fixierung Techniken sind zeitaufwendig. Sie erfordern die Installation zusätzlicher Ausrüstung und erfordern noch Proben zu organischem Lösungsmittel und chemische Fixiermittel ausgesetzt werden, die die Zytoarchitektur verändern können, trotz der Verwendung einer niedrigen Temperatur ^{14, 15.} Daher trotz aller technologischen Fortschritte sowohl bei dem LM und EM – Ebene, chemische Fixierung von Hirngeweben, insbesondere Acrolein, bleibt eine kostengünstige und zeitsparende Methode zu kombinieren Immunhistochemie mit EM ^16.

In den letzten Jahrzehnten wurden viele Versuche unternommen, eine Mischung von Aldehyden zu finden, das die beste Gewebeerhaltung bieten. Vor den 1960er Jahren die einzige Fixiermittel Chemikalie, die akzeptable Ergebnisse für EM gab, war Osmiumtetroxid. Allerdings ist Osmiumtetroxid sehr giftig und teuer, ihre Verwendung durch das Gefäßsystem ausschließen Organe wie das Gehirn zu fixieren. Acrolein wurde in den späten 1950er Jahren als ein zuverlässiges Verfahren für die Tiergewebekonservierung geeignet für EM Beobachtung von Zellstrukturen ¹⁷ eingeführt. Es durchdringt die tiefen Gewebe und reagiert schneller als anderer Aldehyde , wenn zur Fixierung durch Eintauchen verwendet , und ermöglicht eine gute Konservierung zytoplasmatischer Komponenten mit minimaler Schrumpfung des Gewebes ^17. Ein solches Merkmal ergibt Fixierung acrolein einen klaren Vorteil gegenüber anderen Aldehyden in frischem Gewebe bei der Verwendung, durch eine genauere Lokalisierung von lebenden molekulare Verbindungen ermöglichen, wie Enzyme und andere Proteine , ^18. Tatsächlich hat es sich als einfache, effiziente und kostengünstige Methode der Fixierung für Visualisierung an der EM-Ebene in vielen Arten, darunter Amphibien und Nagetiere, wie sie effizient stabili im Laufe der Jahre validiertZES Peptide und Proteine, behalten Antigenität und liefern relativ intakt Ultrastruktur , wenn ¹⁶ in Kombination mit einem anderen Aldehyd Fixativ ^{verwendet, 18, 19, 20, 21.} Protokolle für Acrolein Fixation in Nagetieren seitdem wurden umfassend, vor allem durch die Pickel – Gruppe, zur Umsetzung dual Immunomarkierung für EM ^{16, 22} standardisiert und verwendet. Einige Gruppen haben Acrolein Fixation in nicht-menschlichen Primaten – Hirngewebe ²³ verwendet. Jedoch unser Wissen gibt es nur ein veröffentlichtes Protokoll effizient chemische Fixierung mit Acrolein in nicht-menschlichen Primaten beschreibt , die kompatibel sind mit EM Immunmarkierung ^24.

In diesem Artikel stellen wir eine einfache und zuverlässige Methode effizient chemisch nicht-hum zu behebenein Primaten Gehirne mit Acrolein, so dass für eine potentiell langfristige Konservierung sowie vor Einbettungs Immunomarkierung und Übertragung EM Prüfung.

Protocol

Ethik-Statement: Alle Protokolle Tiere beteiligt sind, wurden durch die Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Ed. 2) hergestellt. Das hier beschriebene Protokoll wurde von ca. 800 g für ausgewachsene Tiere optimiert. Die Volumina des Fixiermittel sollte nach dem Tiergröße angepasst werden. 1. Herstellung von Lösungen für die t…

Representative Results

In diesem Abschnitt präsentieren wir repräsentative Ergebnisse, die nach der Beobachtung erhalten wurden, bei der Übertragung EM-Ebene, von immunhistochemisch primate Hirngewebe chemisch mit einem Gemisch aus 3% Acrolein und 4% PFA fixiert. Wir erzielen gute Konservierung der Ultrastruktur, wie durch die relativ intakte Myelinscheide und der reinen Visualisierung von Doppelmembranen (2A) angedeutet ist . Synaptische Kontakte zusammen mit neuronaler Elemente aus der Mi…

Discussion

In diesem Artikel präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll für transkardiale Perfusion von nicht-menschlichen Primaten und Pre-Embedding Immunhistochemie geeignet für EM Probenprüfung. Obwohl typische Kryo-EM, wie CEMOVIS, eine gute Erhaltung des Gehirns Ultra bietet, schränkt sie auch die Verwendung von Immunhistochemie ^12. Andere Techniken, einschließlich Kryo-Substitution und Tokuyaso Technik erlauben post-Einbettungs Immunhistochemie, aber diese Techniken sind teuer aufgrund zusät…

Materials

Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O)	EM Science	SX0710-1
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table	Mopec	CE400
Electronic perfusion pump	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades	Feather           lance	201011           J9913	No.22 for surgery and    No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% dilution
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4)	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% dilution
Cold-fish gelatin	Aurion	900.033	0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 dilution
Primary antibody, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
Primary antibody, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8.8 µL/mL of A and B each
3'3 diaminobenzidine (DAB)	Sigma	D5637	0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron microscopic science	2% 19152           4% 19150	Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin	sigma	A: M epoxy resin (44611)                B: hardener 964 (44612)                C: accelerator 960 (DY 060)  (44613)               D: plasticizer (44614)	Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups	Electron microscopic science	70048-01
Ethanol	commercial alcohols	1019C	Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide	Electron microscopic science	20401	Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides	brain research laboratories	3875-FR	Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film)	Electron microscopic science	50425-25	Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome	Leica UC7	EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim)	Diatome	UT 1081	Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife	Diatome	MC13437	equipped with a boat
Xylenes	Fisher scientific	X5SK-4
150-mesh copper grids	Electron microscopic science	G150-cu
grid-box	Electron microscopic science	71138	Can store up to 100 grids
Sodium citrate	Anachemia	81983
Lead nitrate	sigma	L-6258	Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe	terumo	SS-05L	5 mL
Syringe filter	corning	431222	0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper)	Electron microscopic science	70086-1
Parafilm	Laboratory film	PM-999
Mineral oil	Sigma	M5904