使用BrUTP链特异性转录运行的（TRO）方法终止转录分析
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
这份手稿描述了在体内检测转录终止缺陷的协议。这里描述使用BrUTP的具体链-TRO协议是在生理条件下分析转录终止缺陷强大的实验方法。像传统的TRO测定法，它依赖于超出基因作为转录终止缺陷1的指示器的3'端的转录活性的聚合酶的存在。它克服了与传统的TRO测定遇到的两个主要问题。首先，它可以检测是否聚合酶通过终止信号读出的是，从启动子近侧区启动转录的一个，或者如果它被简单地表示该发起非特异性从身体某处一个普遍地转录聚合酶或3'该基因的末端。其次，它可以区分，如果转录活性聚合酶信号超出终止区是真正的通读义mRNA转录聚合酶或终止子启动的非编码反义RNA的信号。简单地说，该协议涉及透的指数生长的酵母细胞中，从而允许在体内启动在BrUTP核苷酸的存在下伸长，由亲和方法纯化BrUTP标记的RNA的转录，逆转录纯化的新生RNA和扩增的cDNA用链特异性的引物侧翼启动子和基因2的终止子区域。
Introduction
真核转录周期包括三个主要步骤;起始，延伸和终止。转录由RNA聚合酶II终止包括两个不同的，相互依存的步骤3。第一步包括裂解，多腺苷酸化和mRNA的释放从模板，并紧接着第二个步骤，通过从所述模板的聚合酶脱开标记。适当的终止是聚合酶的转录起始/再引发在回收至关重要的，用于防止干扰的下游基因的转录，并为通过限制普遍非编码RNA 4,5转录保持异常转录检查。尽管最近的进展，终端是迄今为止RNA聚合酶II转录周期的最不被理解的一步。一个可靠的终止试验是研究机制underlyin至关重要通过体内 RNA聚合酶II转录克终止。
许多实验方法是用来检测在生理条件下可主动转录基因终止缺陷。这些措施包括Northern杂交，终止因子芯片（染色质免疫沉淀）和传统TRO检测。每种技术具有一定的优点和缺点。所使用的传统的TRO测定是在体内 1检测的转录终止缺陷的最可靠和灵敏的方法。该测定本地化于细胞内的基因的不同区域的转录活性聚合酶分子。在正常情况下，该测定显示了转录接合聚合酶分子严格分布的基因（ 图1A）的启动子和终止子区域之间。在有缺陷的终止，然而，聚合酶是无法读取终止信号并在该基因（ 图1B）的3'端下游的区域进行检测。
转录终止缺陷主要表现在从启动子近侧区发起感-转录聚合酶存在，并且是无法读取终止信号，继续转录的基因的3'末端的下游区， 如图2A。与真核基因组中表现出感压倒性普遍存在的转录以及反义方向和周围的基因6，7，8，9，10的实现，它很快变得清晰，传统的TRO测定无法检测，如果聚合酶信号一个基因的下游代表的启动子启动的转录物（ 图2A）或发起索姆的异常的RNAewhere在基因或终止子元件（ 图2B），或从基因（ 图2C）的3'末端的反义方向的聚合酶转录的下游的中间位置。如果观测到的通读聚合酶信号表示启动子启动的扩展感的mRNA或发起检查中的基因的下游的反义转录物的链特异性TRO测定此处描述的使用BrUTP可以区分。我们已经成功地使用这种方法来证明在芽殖酵母2中转录终止Kin28激酶的作用。这里采用的办法，我们表明，Rna14需要在芽殖酵母ASC1的转录终止。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里使用的链特异性TRO协议是改编自哺乳动物细胞12用于GRO-SEQ（全球运行在测序）分析的协议。我们成功修改了协议，来研究转录新生在芽殖酵母。要具体分析转录终止缺陷，我们通过摆脱RNA水解步骤的进一步调整的协议。这使我们能够特异性检测来自子区靠近转录起始位点开始的全长新生转录物。
有迹象表明，应以最大的谨慎进行以获得有意义的结果在?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Referencias
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