Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi
Summary
Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.
Abstract
Kimyasal temizleme protokolleri ile birlikte, ışık saçlı floresans mikroskobu (LSFM), büyük biyolojik örneklerde flüoresan etiketli yapıların analizi için altın standart haline geldi ve hücresel çözünürlüğe indirgendi. Bu arada, temel protokollerin sürekli arıtılması ve uzmanlaşmış ticari sistemlerin artan kullanılabilirliği, tüm fare organlarının mikroyapısını araştırmamızı ve hatta çeşitli canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarında hücresel davranışın karakterizasyonuna izin vermemizi sağlıyor. Burada, iltihaplı fare kalplerindeki CD45 + lökosit popülasyonunun mekansal tüm montaj görüntüsü ve miktarının belirlenmesi için bir protokolü açıklıyoruz. Yöntem ölümcül kardiyak aritmilerle karakterize fulminan ölümcül miyokardit gelişimi için son zamanlarda sağlam ve endüklenebilir bir model olarak hizmet ettiği gösterilmiş bir transgenik fare soyunu (CD11c.DTR) kullanmaktadır. Bu protokol miyokardit indüksiyonu, intravitAl antikor aracılı hücre boyaması, organ hazırlığı ve LSFM'den sonra bilgisayar destekli görüntü sonrası işleme tabi tutulur. Belirli bilimsel sorunuz için oldukça uyarlanmış bir yöntem olarak sunulmasına rağmen, protokol, diğer organlarda ve hatta diğer türlerde bile tamamen farklı florasan yapıları hedefleyebilen kolayca ayarlanabilen bir sistemin planını temsil etmektedir.
Introduction
Işık mikroskopisinin gelişimi sırasında, birçoğu özel formlar ortaya çıktı, bunların hepsi belirli örnekler için görselleştirme sürecindeki sınırlamaları en aza indirmek için geliştirildi. Böyle bir yöntem, ışık saçlı floresan mikroskobu (LSFM) 'dir. İlk olarak 1903'te Siedentopf ve Zsigmondy 1 tarafından geliştirilmiş ve 1990'ların başında ilk temel biyolojik uygulamaları bulan 2 , LSFM, flüoresan sinyal çözünürlüğü ile bozulmamış fare organları gibi büyük örneklerin görselleştirilmesi için şimdiye kadarki en güçlü mikroskopik araç haline gelmiştir Hücresel seviyeye iner. Bu avantajlardan dolayı, canlı hücre görüntüleme potansiyeli ile birlikte Nature Methods LSFM "Yılın Metodu 2014 3 " olarak adlandırılmıştır.
Adından da anlaşılacağı üzere, bir LSFM'deki örnek aydınlatma, kullanılan objektifin eksenine dikey olarak yönlendirilmiş ışık saçak levhaları tarafından yürütülür.Veya emisyon ışık toplama ve müteakip görüntü oluşumu. Işık tabakası genellikle silikon lensli geniş, kollektrik lazer ışınlarına odaklanarak veya dar, odaklanmış lazer ışınlarının hızlı yatay hareketiyle sadece bir yatay veya dikey düzlem 4 , 5'de oluşturulur. Böylece görüntüleme optiklerinin sadece odak düzlemi, tipik olarak 1-4 μm kalınlıkta aydınlatılır. Sonuç olarak, aydınlatma düzlemine yerleştirilen bir flüoresan numune için hem dağınık ışık üretimi hem de odak düzleminin üstündeki veya altındaki bölgelerden gelen foto-ağartma etkileri elimine edilir veya büyük ölçüde bastırılır 6 , 7 . Odak dışına çıkan tüm düzlemler aydınlatılamadığından, bu alanlarda fotoblokaj efektleri ihmal edilir. Standart konfokal veya çoklu foton mikroskopisinin aksine, aydınlatılmış ve yayılan ışık yolları birbirinden ayrıdır, bu nedenle son görüntü niteliği Uyarı ışık ışınının hedefler boyunca mükemmel şekilde odaklanmasına bağlı değildir. Bu nedenle, altta yatan soruya bağlı olarak, aydınlatılmış düzlemin mümkün olan en geniş alanı, xy yönünde hareket eden herhangi bir bileşen parçası olmadan görüntülenecek şekilde muazzam bir görüş alanına sahip hedefleri (FOV) kullanmak mümkündür.
Modern LSFM sistemlerinde, üretilen optik bölümün flüoresan görüntüsü, tüm görüş alanını (FOV) elde edebilen oldukça hassas bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) veya tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kameralar üzerinde yakalanır. Mikrosaniye cinsinden. Bu nedenle, numuneyi ışık tabakası boyunca hareket ettirerek ve tanımlanmış z adımlarında görüntü elde ederek, bu tekniği canlı hücre için geçerli hale getiren makul bir süre 8 , 9 olan bir numunenin tam 3D bilgisini elde etmek mümkündür Çalışmalar 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Bununla birlikte, LSFM hızlı, hassas ve fluoresan dostu bir yöntem sunsa da, özellikle büyük biyolojik numuneler bir 3B analizi için hedef olduğunda, örnek üzerinden ışık iletimi hala önemli bir konudur. Işık iletimi, emilimin fiziksel yönleri ve farklı kırılma indeksleri olan yapıların ara yüzlerindeki ışık saçılımıyla eleştirel olarak modifiye edilmiştir 13 . Bu nedenle, görüntüleme örnekleri birkaç milimetre boyutunda olduğunda LSFM, çoğunlukla örnekleri optik olarak şeffaf hale getirmek için temizleme protokolleriyle birleştirilir. Bu teknikler, suyun ilgili biyolojik dokudan çıkarılması ve belirli hedef doku bileşenlerinin kırılma indekslerine dar bir şekilde uyacak şekilde seçilen su veya organik solvent bazlı daldırma ortamlarıyla değiştirilmesi fikrine dayanmaktadır. Sonuç olarak, yanal ışık saçılımı en aza indirilir ve tüm dalga boylarıIşığın dokudan daha etkin bir şekilde geçebileceğini 13 . Birçok durumda, bu şekilde tedavi edilen biyolojik örnekler makroskopik açıdan berrak görünür ve LSFM'nin tüm fare organlarında bile uzun çalışma mesafesi, düşük büyütme hedefleri kullanılarak gerçekleştirilmesini sağlar.
Burada, miyokardit 15'teki bir fare modelinde hücresel kardiyak infiltratı araştırmak için kurduğumuz ışık saçlı mikroskopta (materyal tablosuna bakınız) geniş örneklem görüntüleme için bir hazırlama protokolü sunulmaktadır. CD11c.DTR fareleri primat difteri toksin reseptörünü (DTR) CD11c promotor 16 kontrolü altında ifade eder. Sonuç olarak, DTR ile birlikte CD11c'yi eksprese eden bu farelerdeki hücreler, Corynebacterium difteri (difteri toksini, DTX) ekzotoksinine duyarlı hale getirilir; Bu hayvanların DTX ile sistemik olarak muamele edilmesi, tüm CD11c + ce'nin tükenmesine yol açarrf. CD11c, bir integrindir ve çeşitli farklı çözünür faktörler için bir hücre yüzeyi reseptörü olarak, esasen monositik soy 17 hücrelerinde aktivasyon ve olgunlaşma süreçlerinde yer alır. Sonuç olarak CD11c.DTR fare modeli, birçok farklı immünolojik soru bağlamında dendritik hücrelerin ve makrofaj alt kümelerinin rolünü incelemek için yoğun bir şekilde kullanılmıştır. Zamanla, sistemik olarak DTX ile tedavi edilen CD11c.DTR farelerinin yan etkiler geliştirebileceği ve yüksek mortalite oranlarını 18 , 19 görüntüleyebildiği bildirildi. Son zamanlarda, bu hayvanlarda intratrakeal DTX uygulaması sonrasında fulminan miyokardit gelişimini tanımlayan temel ölüm nedenini tanımladık. Toksin uyarısı, kalpteki uyarıcı iletim sisteminin merkez kısımları da dahil olmak üzere hücresel yıkıma neden oldu. Buna büyük CD45 eşlik ediyordu+ Lökosit infiltratı, sonuç olarak öldürücü kardiyak aritmilere yol açar. Bu durumda, sadece lökosit popülasyonunun ortaya çıkışı değil, kalpteki mekansal dağılımı da önemli idi. Bu deneysel soru, intravital antikor boyama ve organik solvent bazlı optik temizleme protokolü tarafından desteklenen bir ışık levha mikroskopik yaklaşımla çözülen modern mikroskobik görüntüleme için bir sorundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modern yaşam biliminde, biyolojik süreçlerin mikroskopik olarak görselleştirilmesi gittikçe önemli bir rol oynamaktadır. Bu bağlamda, son iki yüzyılda bu noktaya kadar adreslenemeyen sorulara cevap bulmaya yardımcı olan birçok gelişme sağlandı. Birincisi, ışık mikroskoplarının çözünürlük yeteneğini temelde arttırma eğiliminde olmuştur. Yapısal aydınlatma mikroskopisi (SIM) 21 , 22 , stimulated emission-depletion (STED) mikroskopi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gunzer laboratuarında yapılan araştırmalar Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (AD 0315590 no'lu hibe ile) ve Alman Araştırma Vakfı (hibe numarası GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) tarafından desteklendi. Teknik destek için IMCES'e, 3D karikatür modellemede yardım için Sebastian Kubat'a da teşekkür ediyoruz.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
Referencias
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
