Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel
Summary
Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.
Abstract
Inzicht membraaneiwit mensenhandel, assemblage en expressie vereist een aanpak die onderscheid maakt tussen degenen die woonachtig zijn in de intracellulaire organellen en die gelokaliseerd op het plasmamembraan. Traditionele fluorescentie metingen niet de mogelijkheid om membraaneiwitten die in verschillende organellen onderscheiden. Cutting edge methodologieën overstijgen traditionele methoden door het koppelen van pH-gevoelige fluoroforen met een totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM). TIRF verlichting wekt het monster tot circa 150 nm van het glas-monsterscheidingsvlak dus afneemt achtergrond, waardoor de signaal-ruisverhouding en verbeteren resolutie. De excitatie volume TIRFM omvat het plasmamembraan omgeving organellen zoals de perifere ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is een pH-gevoelige versie van GFP. Genetisch codeert september in het extracellulaire domein van een membraaneiwit plaats positioneert het fluorofoor opde luminale zijde van het ER en het extracellulaire gebied van de cel. September fluorescerend als de pH hoger dan 6, maar blijft in de uit-toestand bij lagere pH-waarden. Daarom receptoren gelabeld met september fluoresceren wanneer geïntegreerd in het endoplasmatisch reticulum (ER) of bij het inbrengen in het plasmamembraan (PM) maar niet als beperkt tot een handel blaasje of andere organellen zoals het Golgi. De extracellulaire pH kan worden ingesteld op de fluorescentie van receptoren dicteren op het plasmamembraan. Het verschil in fluorescentie tussen TIRF beelden bij neutrale en zure pH voor extracellulaire dezelfde cel overeen met een relatieve aantal receptoren op het plasmamembraan. Dit maakt een gelijktijdige meting van intracellulaire en plasmamembraan resident receptoren. Single blaasje inbrengen gebeurtenissen kunnen ook worden gemeten wanneer de extracellulaire pH-neutraal, wat overeenkomt met een lage pH mensenhandel blaasje fuseren met het plasmamembraan en de overgang naar een fluorescerende toestand. dit versatile techniek kan worden benut om de lokalisatie, expressie, en de handel van membraaneiwitten te bestuderen.
Introduction
Veranderingen in receptorexpressie, distributie en montage zijn verbonden met een groot aantal ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, cystische fibrose, en drugsverslaving 1, 2, 3, 4, 5. Bijvoorbeeld nicotine en andere nicotine liganden beïnvloeden de handel in nicotinische acetylcholinereceptoren (nAChRs) hetgeen leidt tot veranderingen in de handel, expressie en opregulatie 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nicotine verhoogt het totale aantal verzamelde nAChRs in een cel verhoogt handel naar de plasmamembraan, eend verandert de assemblage van subeenheden om een hoge gevoeligheid versie van bepaalde subtypen bevorderen. Het oplossen van verschillende veranderingen in de handel, assemblage, en de expressie van receptoren in een ziektemodel biedt cruciale mechanistische details die essentieel zijn voor drug targets te definiëren zijn. Een ideale aanpak zou snel onderscheiden intracellulaire receptoren en die gelokaliseerd op het plasmamembraan. Deze Vooral in gevallen waarin een meerderheid van een bepaald eiwit intracellulair bevindt, zoals bij nAChRs. Aangezien het merendeel van de nAChRs worden gelokaliseerd in het endoplasmatisch reticulum, traditionele metingen missen de spatiotemporele resolutie die nodig zijn om de lokalisatie en de handel veranderingen langs de secretieroute lokaliseren. Receptor mensenhandel en expressie studies van nAChRs zijn voornamelijk uitgevoerd met behulp van radioligand binding 11, biotinylering assays 12, western blotting 13 of immunoprecipitatie techniq UES 12. Deze zijn afhankelijk van de bindingsspecificiteit van een reporter molecuul of fixatie van cellen missen het vermogen om gelijktijdig onderscheiden plasmamembraan inwoner intracellulaire receptoren. Daarom zijn studies van ionkanaal assemblage en blaasjes dynamiek grotendeels vertrouwd op low-throughput elektrofysiologische technieken 14.
Superieure ruimtelijke en temporele resolutie is mogelijk met de vooruitgang in fluorescentie microscopie. Genetisch gecodeerde reporter moleculen, zoals groen fluorescent eiwit (GFP) en varianten, niet-specifieke binding te elimineren problemen en gevoeligheid 15 verhogen. Een pH-gevoelige variant van GFP, bekend als superecliptic pHluorin (SEP), kan worden gebruikt om de pH inherente verschillen tussen compartimenten in een cel benutten om te bepalen lokalisatie 5, 7, 8,ref "> 9, 16, 17, 18. september fluoresceert bij een pH hoger dan 6, maar blijft in de uit-toestand bij lagere pH. Daarom receptoren gelabeld met SEP de luminale zijde worden wanneer in het endoplasmatisch reticulum onderhavige gedetecteerd ( ER) of bij het inbrengen in het plasmamembraan (PM), maar niet als beperkt tot een handel blaasje. Manipulatie van de extracellulaire pH in contact met receptoren op het plasmamembraan verandert bijgevolg de fluorescentie en daardoor detectie van deze receptoren. Als dezelfde cel achtereenvolgens afgebeeld op zowel neutrale extracellulaire pH en vervolgens een pH lager dan 6, wordt het verschil tussen de beelden toegeschreven aan receptoren op het plasmamembraan. Dit maakt een gelijktijdige meting van intracellulair (perifere ER) en plasmamembraan resident receptoren 5, 7, 8 </sup>, 9. Single blaasje inbrengen gebeurtenissen kunnen ook worden opgelost wanneer de extracellulaire pH-neutraal is. Zodra een lage pH handel vesicle gen met de plasmamembraan is de luminale zijde van het blaasje blootgesteld aan de extracellulaire neutrale oplossing, waardoor een transitie gedetecteerd als een uitbarsting van fluorescentie 7, 18, 19, 20. September maakt de meting van receptoren gelokaliseerd in het plasmamembraan en perifere endoplasmatisch reticulum, en een middel voor transport van receptoren tussen deze subcellulaire gebieden 5, 7, 18 te meten.
Een hogere resolutie in het plasmamembraan te bereiken is een receptor met september genetisch gecodeerde afgebeeld door totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM). Deze methode is vooralhandig als de meeste receptoren gelokaliseerd intracellulaire gebieden, aangezien TIRFM verhoogt de zichtbaarheid van het plasmamembraan. TIRFM maakt het ook mogelijk de resolutie van mensenhandel dynamica van enkele blaasjes dragen september-gelabelde receptoren bij het inbrengen in de PM. Totale interne reflectie optreedt bij het scheidingsvlak van materialen met verschillende brekingsindices, zoals tussen een cel en een glazen afdekplaat slip 21, 22. September fluoresceert bij bestraling met 488 nm excitatie, die is gericht op totale interne reflectie aan het grensvlak van het glas en cel oplossing. Dit levert een uitdovende golf dat ongeveer 150 nm doordringt in de steekproef, alleen spannend fluoroforen binnen dit volume. Slechts september bevattende receptoren in een neutrale pH omgeving binnen dit bereik excitatie gedetecteerd, overeenkomend met die die op het plasmamembraan of perifere endoplasmatisch reticulum. Aangezien detectie is beperkt to excitatie door de uitdovende golf, achtergrondfluorescentie van het intracellulaire gebied wordt gereduceerd en de signaal-ruisverhouding toeneemt 21, 22. Bovendien, omdat de straling niet het grootste deel van de cel doordringen, photodamage geminimaliseerd die beeldvorming van levende cellen in de loop van de tijd mogelijk maakt. Hierdoor TIRFM gekoppeld genetisch gecodeerde september levert de hoge resolutie en gevoeligheid vereist om subcellulaire lokalisatie en handel dynamica van membraanreceptoren te meten langs de secretieroute.
Protocol
Representative Results
Discussion
De pH gevoeligheid van september maakt receptoren die zich op de plasmamembraan te onderscheiden van intracellulaire receptoren in het endoplasmatisch reticulum, en kan worden gebruikt om het inbrengen gebeurtenissen lossen receptor-dragende vesicles 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Diverse technie…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60x, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25×36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
Referencias
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs. Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer’s and Parkinson’s disease–a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I., Ming, L. . Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. 117, (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
