This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.
Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.
בהנדסת רקמות biosensing, את היכולת לשלוט בארגון המרחבי של חלבונים בתאים בסולם מיקרומטר, הפך חשוב יותר ויותר במהלך ארבעת העשורים האחרונים 1, 2, 3. ארגון המרחבי מדויק של חלבונים בתאים אפשר לחוקרים לבחון את יחסי הגומלין בין תאי מצעים המכילים סוגים דומים או שונים של תאים, כדי להדריך את גדילת תאים, וכדי לשתק ביומולקולות עבור הייצור של חיישנים ביולוגיים 4, 5, 6, 7, 8, 9.
השיטות הקיימות כיום של חלבונים דפוסים כוללים photopatterning והדפסה microcontact. Photopatterning מנצל חומר רגיש לאור אשר crosslinked בחשיפה ultrאור סגול (UV). אור UV מכוון photomask (מורכב האזורים שקופים עם אזורים כהים כדי למנוע העברת אור UV) גורם crosslinking באזורים ספציפיים אשר לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ההתקשרות הבאה של חומרים ביולוגיים או תאים 10, 11. בעוד תכנית זו היא מאוד מדויקת ומאפשרת שליטה מדויקת של הטופוגרפיה של שטח התרבות, היא מוגבלת ביומולקולות UV הרגיש שניתן בדוגמת ידי קרינת UV 12. הדפסת Microcontact היא עוד שיטה פופולרית של דפוסי חלבונים ספציפיים 13, 14. בשיטה זו, siloxane פולי-דימתיל (PDMS) חותמת מטופל עם מגוון רחב של חומרים כימיים שינוי פני השטח בטרם ספוג בתמיסה של המצע וביומולקולרית הנבחר. הוא הקיש בעדינות על coverslip זכוכית או משטח אחר כך "הטבעה" את biomolecule על גבי משטח תרבות. הוwever, ביול מוגבל לסוג החומר שניתן להעביר כמו גם יכולת רטיבות של ביומולקולות אל פני השטח של PDMS להחתים 15.
דפוסים ישירים של תאים יכולים להיות יותר קשים ומסתמכים על שיטות מורכבות כגון מצעים להחלפה, שיטות המבוסס סטנסיל, או דפוסים עם מולקולות הדבקת תא ספציפיות 16, 17. שיטות אלו מוגבלים ביכולתם תאי דפוס בשל חוסר מצעי הידבקות תא תואמים, אי התאמה של התהליך לעבוד עם תאים ואילוצים ביולוגיים רגישים, חוסר עקביות לשחזר את הדפוסים, ומורכבות ההליך. לדוגמא, עם מצעים להחלפה, מצעים מותאמים אישית צריכים להיות מתוכננים עבור כל סוג תא, לעבור דבקותם סוגי תאים מסוימים ללא שפלה בחשיפה לאור UV והחום המשמש בתהליך 17, < sup class = "Xref"> 18, 19, 20. שיטות דפוסים סטנסיל מבוססות הם צדדים ביכולתם תאי דפוס; עם זאת, קשה לייצר שבלונות PDMS על עוביים המתאים לשימוש 16, 21. הזרקה ישירה של תאים לתוך ערוצי microfluidic PDMS יש כמה יתרונות כגון: 1) להקל על ייצור של ערוצי microfluidic ו -2) והתאמתו תאי מצעים שונים. עם זאת, הנושא הרווחת ללכוד בועות אוויר במהלך תהליך ההזרקה בשל הידרופוביות של PDMS ללא שימוש ניקוי פלזמה, או בשיטות אחרות כדי להקטין בועות אוויר, מקשה ליצור תאים בדוגמת בעקביות על משטחי זכוכית או פלסטיק 21.
עבודה זו מרחיבה נימי micromolding 22, 23,= ילדה "Xref"> 24, 25, 26 ו מדווח שיטה להזריק השעיות חלבון התא לתוך microchannels. השיטה כאן מדגימה את הדפוסים של מצעים ושניהם דפוסים ישירים ועקיפים של סוגי תאים מסוימים. טכניקה זו מתגברת על הידרופוביות הגבוהה של PDMS ומונעת את הנוכחות של בועות במהלך ההזרקה של או מצעים או תאים על ידי ניצול של חדירות הגז של 27 PDMS. מסמך זה מדגים את השימוש בטכניקה עם כמה מצעים שונים סוגי תאים. המאמר מדגיש גם הייצור של תבניות עבור ליתוגרפיה רכה באמצעות photolithography קונבנציונלי וכן פשוטה ושיטת דבק בעלות הנמוכה שימושית משאבי הגדרות מוגבלות 28, 29.
בעוד photolithography הקונבנציונלי היא טכניקה מבוססת היטב ליצירת תבניות עבור ליתוגרפיה רכה, הציוד, חומרים, ואת כישורים דרושים כדי להשתמש photolithography הקונבנציונלי אינם זמינים ברוב המעבדות. למעבדות ללא גישה למשאבים אלה, והצגנו ייצור סרט דביק כשיטה של יצירת תבניות עם תכונות פ…
The authors have nothing to disclose.
מימון למחקר זה סופק על ידי ועדת ניו ג'רזי בחקר חוט השדרה (NJCSCR) (כדי FHK), להעניק CSCR14IRG005 (כדי BLF), NIH מענק R15NS087501 (כדי CHC), וקרן קירבי FM (כדי ETA).
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |