Turbidimetría en plaquetas humanas lavadas: El efecto de la Pannexin1-inhibidor de azul brillante FCF sobre la agregación inducida por colágeno
Summary
Se describe un método sencillo para el aislamiento de plaquetas lavadas a partir de sangre humana seguido por mediciones de la agregación plaquetaria inducida por agonistas por turbidimetría. Como un ejemplo aplicamos este método para estudiar la respuesta de agregación de plaquetas humanas a colágeno después de un pre-incubación con el inhibidor de canales Pannexin1 Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetría es una técnica de laboratorio que se aplica para medir la agregación de plaquetas en suspensión en cualquiera de plasma (plasma rico en plaquetas, PRP) o en tampón (plaquetas lavadas), por el uso de uno o una combinación de agonistas. El uso de plaquetas lavadas separados de su entorno de plasma y en ausencia de anticoagulantes permite estudiar las propiedades de plaquetas intrínsecas. Entre el gran panel de agonistas, ácido araquidónico (AA), adenosina difosfato (ADP), la trombina y colágeno son los más utilizados. La respuesta de agregación se cuantifica midiendo la densidad óptica relativa (OD) con el tiempo de suspensión de plaquetas bajo agitación continua. Las plaquetas en suspensión homogénea limitan el paso de la luz después de la adición de un agonista, el cambio de forma de plaquetas se produce la producción de un pequeño aumento transitorio de la OD. Después de esta etapa de activación inicial, la formación de coágulos de plaquetas forman gradualmente, lo que permite el paso de luz a través de la suspensión como una resULT de la disminución de OD. El proceso de agregación se expresa en última instancia como un porcentaje, en comparación con la OD de plasma o tampón pobre en plaquetas. calibración rigurosa tanto, es esencial al comienzo de cada experimento. Como regla general: calibración a 0% se establece mediante la medición de la DO de una suspensión no estimulada de plaquetas mientras se mide la DO del medio de suspensión que no contiene plaquetas representa un valor de 100%. La agregación plaquetaria es generalmente visualizado como una curva de agregación en tiempo real. Turbidimetría es una de las técnicas de laboratorio más comúnmente utilizados para la investigación de la función plaquetaria y se considera como el estándar de oro histórico y se utiliza para el desarrollo de nuevos agentes farmacéuticos dirigidos a la inhibición de la agregación plaquetaria. A continuación, describimos protocolos detallados para 1) la preparación de plaquetas humanas lavadas y 2) análisis turbidimétrico de la agregación inducida por colágeno de plaquetas humanas lavadas previamente con el colorante alimenticio azul brillante FCF que fue recientemente idenficados como un inhibidor de Pannexin1 canales (Panx1).
Introduction
Las plaquetas son componentes cruciales de la sangre y su principal función junto con factores de coagulación-es para detener el sangrado después de una lesión de los vasos sanguíneos. Las plaquetas son fragmentos pequeños (2-3 m) anucleares derivadas de megacariocitos de la médula ósea 1. Las plaquetas circulan en estado no activado, durante el que aparecen como estructuras en forma de lente. Tras la interrupción del endotelio, las plaquetas se reúnen para el sitio de la lesión de los vasos sanguíneos para tapar el agujero, un proceso llamado hemostasia primaria. Inicialmente, las plaquetas se adhieren a las moléculas de sub-endotelial, como el colágeno y el factor de von Willebrand, que se exponen como resultado de la etapa de lesión-adhesión 2. Luego, se cambian de forma y secretan paso mensajeros-activación química. Finalmente, se conectan entre sí por puentes paso receptores de agregación. hemostasia primaria es seguida por un proceso secundario que implica la activación de la cascada de coagulación con la deposición de fibrina, que estabilizans trombo inicial 2.
Eventos isquémicos agudos tales como infarto de miocardio 3 menudo el resultado de los trombos que se forman a causa de la interrupción física (ruptura) de una placa aterosclerótica. fármacos antiplaquetarios actuales son la piedra angular del tratamiento de esta enfermedad muy extendida pero su beneficio clínico está limitado por un aumento del riesgo de sangrado. Los fármacos más prescritos en pacientes cardiovasculares, compuestos de aspirina y anti-P2Y12, Target el tromboxano A2 y las vías de ADP 4, respectivamente, que son las principales vías que conducen a la activación plaquetaria. Sin embargo, la investigación innovadora hacia nuevos objetivos que equilibrar de manera óptima los efectos antitrombóticos y el riesgo hemorrágico sigue siendo necesaria.
Desde la década de 1960 hasta la actualidad 5, agregometrıa turbidimétrico ha jugado un papel crucial en la investigación, mejorar nuestro conocimiento de la reactividad plaquetaria y yon el seguimiento de la potencia de los reactivos anti-trombóticos en los seres humanos. Turbidimetría se aplicó inicialmente a PRP extraído de muestras de sangre. De hecho, la recogida de sangre a cabo en tubos que contienen citrato permite una producción rápida y grande de PRP sin tener ningún efecto sobre la integridad de las plaquetas y la función. Sin embargo, la estabilidad a corto plazo (aproximadamente 3 h) de PRP y las enzimas plasmáticas restantes, tales como trombina, y la baja concentración de calcio asociado con perfiles de agregación potencialmente artefactual son de gran inconveniente para la utilización de PRP. Un avance importante ha sido el desarrollo de un método para el aislamiento de plaquetas con centrifugación y etapas de lavado 6 adicional. En resumen, PRP está aislado de la sangre total extraída en ácido-citrato-dextrosa (ACD) y las plaquetas se aisló después de etapas de centrifugación de serie antes de ser resuspendido en un tampón iso-osmótica fosfato (tampón de Tyrode) que contenía glucosa, albúmina de suero humano y divalente cciones (Ca2 + y Mg2 +). Para evitar cambios en la reactividad de las plaquetas, el pH del tampón de Tyrode es cuidadosamente mantenida a 7,35 hasta 7,4. Además, la activación no deseada de las plaquetas se evita mediante la adición de la prostaciclina (PGI 2) antes de que algunos pasos de centrifugación. Finalmente, la adición de apirasa evita que las plaquetas lavadas se vuelvan resistentes contra la acción de ATP / ADP. La suspensión de plaquetas resultante carece de factores coagulantes y la estabilidad de las plaquetas se aumenta en al menos dos veces en comparación con soluciones de PRP. Además, el hecho de que las plaquetas son órdenes inactivos pero intactas la reproducibilidad de las mediciones turbidimétricos y proporciona la capacidad para estudiar la acción de los agonistas o antagonistas de la agregación de plaquetas de una manera óptima.
Usando este método, hemos demostrado en un estudio reciente que la inhibición de la formación de canales Panx1 por un enfoque genético (knock-out ratones) o disminuyendo la actividad del canal Panx1 por farmacológicaenfoques reducida agregación plaquetaria inducida por colágeno 7. Panx1 forma canales de liberación de ATP, que se expresan ubicuamente en muchos tipos celulares, incluyendo plaquetas humanas 7, 8. De hecho, hemos demostrado por turbidimetría en plaquetas humanas lavadas que una preincubación de 7 min con un panel de más o menos específicos bloqueadores químicos (probenecid, mefloquina y 10 péptidos Panx1) antes de la adición de diversos agonistas, inhibido específicamente inducida por colágeno- la agregación de plaquetas mientras que las respuestas de plaquetas a AA y ADP no se vieron afectados. Hemos demostrado que la liberación de ATP a través de canales Panx1 interfiere específicamente en la vía de señalización GPVI conduce a la agregación inducida por colágeno. Curiosamente, varios compuestos aprobados por la FDA con aplicaciones en otras enfermedades (probenecid, mefloquina) afectan a la actividad de los canales Panx1 en plaquetas. Por un lado, esto abre nuevas perspectivas terapéuticas para seleccionarIvely modificar la reactividad plaquetaria. Por otro lado, se debe considerar los posibles efectos secundarios de estos compuestos. En este contexto, el colorante alimentario seguro Brilliant Blue FCF utiliza en múltiples dulces y bebidas energéticas se ha descrito como un inhibidor selectivo de Panx1 9. Se describe aquí un protocolo para el aislamiento de plaquetas lavadas humanas y mediciones turbidimétricas de la agregación plaquetaria adaptado para investigar el efecto del colorante azul de FCF Brilliant como un antagonista de la agregación plaquetaria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay un gran interés en la búsqueda de nuevos fármacos capaces de modular la función de las plaquetas con el fin de prevenir la trombosis sin aumentar el riesgo de hemorragia. Para este propósito, in vitro pruebas de laboratorio que fiable y reproducible pueden monitorear las respuestas de agregación en plaquetas humanas son absolutamente necesarias. agregometrıa turbidimétrico es una técnica fácil de realizar. Sin embargo, algunas precauciones deben tenerse en cuenta. Las mediciones deben realizarse c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (310030_162579 / 1 a Brenda Renata Kwak y 320030_144150 a Pierre Fontana), así como por una beca de la Fundación Suiza del corazón.
Materials
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | – |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | – |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | – |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | – |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | – |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | – |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | – |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | – |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | – | – |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | – |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | – |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | – |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | – |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | – | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | – |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | – | – |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | – |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | – |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | – |
Referencias
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