Эффективный и гибкий метод Cell агрегация для 3D сфероида производства

Summary

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Abstract

Однослойная культура клеток не адекватно моделировать поведение в естественных условиях тканей, который включает в себя сложные межклеточные и клетка-матрица взаимодействий. Трехмерные технологии (3D) культивирования клеток являются недавнее нововведение разработано для устранения недостатков культуры прикрепленных клеток. В то время как несколько способов генерации аналогов ткани в пробирке, были разработаны, эти методы часто сложны, дороги , чтобы установить, требуют специализированного оборудования, и , как правило , ограничены совместимостью только с определенными типами клеток. Здесь мы описываем быстрый и гибкий протокол для агрегацию клеток в многоклеточных 3D сфероидов одинакового размера, который совместим с ростом различных опухолевых и нормальных клеточных линий. Мы используем различные концентрации в сыворотке крови и метилцеллюлозы (MC), чтобы способствовать анкерное-независимого сфероид поколения и предотвратить образование монослоев клеток в высоко воспроизводимым образом. Оптимальные условия для Individual клеточные линии могут быть достигнуты путем регулировки MC или сывороточные концентрации в сфероида пластового среде. 3D-сфероиды, сгенерированные могут быть собраны для использования в широком диапазоне применений, в том числе клеточных сигналов или исследований экспрессии генов кандидата скрининга лекарственных средств, или в изучении клеточных процессов, таких как инвазии опухолевых клеток и миграции. Протокол также легко адаптировать для создания клоновых сфероидов из одиночных клеток, и могут быть адаптированы для оценки анкерное-независимый рост и anoikis резистентность. В целом, наш протокол обеспечивает легко изменяемый способ генерирования и использования 3D сфероиды клеток для того , чтобы Повторим 3D микроокружение тканей и смоделировать рост в естественных условиях нормальных и опухолевых клеток.

Introduction

Биологически соответствующая оценка поведения опухолевых клеток является сложной задачей с использованием традиционных двумерных (2D) методологии клеточной культуры, отчасти потому , что они не могут адекватно отразить микросреды клеток нашли в естественных условиях. Альтернативные подходы , включающие компоненты внеклеточного матрикса в культуре (например, Бойденом камерные анализах) являются более физиологически представитель естественных условиях окружающей среды ткани в. Тем не менее, они могут быть ограничены оценкой индивидуального поведения клеток, и не резюмировать комплекса в комбинации прижизненного клеточного матрикса и межклеточных взаимодействий , которые способствуют росту ткани или опухоли ^{1, 2, 3.}

Использование многоклеточных сфероидов является недавний подход , который более точно воспроизводит компактную архитектуру роста в естественных условиях клетки ^1,4. Сфероидов может быть использован для исследования клетка-матрица взаимодействия нормальных клеток, но могут также выступать в качестве аналогов опухолевые для моделирования характеристик прогрессии опухоли, такие как рост метастазов или резистентности к лекарственным препаратам ^4.

Сфероиды могут быть образованы путем пролиферации отдельных клеток , внедренных в матрицу ^5, или более быстро, способствуя агрегации нескольких ячеек , чтобы сформировать один кластер клеток (например, висячей капли, методы центрифугирования) ^{6, 7.} Существующие методы агрегации клеток может потребовать дорогостоящих материалов или специализированного оборудования. Кроме того, эти сфероиды имеют широкий диапазон размеров и морфологией и может быть трудно производить в больших количествах, что делает сравнения между условиями роста или лечения сложных. И, наконец, сфероиды, генерируемые этими способами может быть трудно отделить от белковый extracellular матрица, в которой они включены для использования в других приложениях.

Здесь мы описываем надежную и легко изменяемый методологии агрегации клеток для быстрого формирования последовательно размерных сфероидов клеток с использованием коммерчески доступного U-дно электролизера водоотталкивающий пластины и инертную адгезионный матрицу, метилцеллюлоза. После образования эти многоклеточные сфероиды легко выделены для использования в широком диапазоне применений. Протокол также легко адаптировать для создания сфероидов посредством пролиферации клеток, которые могут быть использованы для оценки других клеточных процессов. Здесь мы покажем вторжение клеток анализы, количественно с помощью иммунофлуоресценции окрашивания, а также анализ anoikis, в качестве примера применения этих двух различных протоколов формирования сфероида.

Protocol

Примечание: Все реагенты и расходные материалы перечислены в списке материалов. 1. Сфероид производства по Cell Aggregation Метил раствор целлюлозы: Приготовьте 100 мл 100 мг / мл метилцеллюлозы. Тепло 50 мл сверхчистой Н 2 О до 80 ° С. Добавить 10 г пор…

Representative Results

Мы опишем гибкий и эффективный метод для генерации дискретных сфероиды с использованием клеток отталкивающие пластин и сфероидами средств массовой формации, дополненные MC. При соответствующих условиях МС и сывороткой, отдельные клетки оседать и сцепленных вместе, в…

Discussion

Мы представляем быстрый и гибкий способ получения 3D сфероиды клеток для моделирования архитектуры тканей в естественных условиях с использованием недорогих и широко доступных реагентов. Наш протокол использует не-цитотоксических и адгезионный свойства MC ^8, <sup…

Materials

Buffers
10x Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Calcium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	21114	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride
Name	Company	Catalog number	Comments
For Spheroid Formation
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	For culturing TT cell line
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051	Filter prior to use to remove particulate contaminants
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M7027	Prepare in water to 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	Catalog number	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-10	Chemoattractant
Name	Company	Catalog number	Comments
For Immunofluorescence Microscopy
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	For mounting excised spheroids
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Used to stain actin at 1:200
Bovine Serum Albumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Used in BSA blocking buffer
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Used in MOWIOL mounting medium
ImageJ Software	Freeware, NIH	–	Used for image analysis
Microslides	VWR International	48312-024	For mounting excised spheroids
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Used in MOWIOL mounting medium
Paraformaldehyde	EMD-Millipore	PX0055-3	Used in fixation buffer
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Used in permeabilization buffer