Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish
Summary
Questo lavoro presenta un nuovo modello in vivo di lesioni segmentali del rene utilizzando gengive transgenici GFP reni. Il modello permette l'induzione dell'ablazione mirata delle cellule epiteliali del rene per mostrare i meccanismi cellulari di lesioni nefroniche e di riparazione.
Abstract
L'infortunio acuto del rene (AKI) è una condizione medica comune con un elevato tasso di mortalità. Con le abilità di riparazione del rene, è possibile ripristinare adeguata funzione renale dopo un trattamento di supporto. Tuttavia, è necessaria una migliore comprensione del modo in cui la morte e la riparazione della nefronica si verificano a livello cellulare per ridurre al minimo la morte cellulare e per migliorare il processo rigenerativo. Il pronephros di zebrafish è un buon modello di sistema per realizzare questo obiettivo perché contiene segmenti anatomici simili al nefrone mammifero. In precedenza, il modello più comune per studiare le lesioni renali nei pesci era il modello farmacologico di gentamicina. Tuttavia, questo modello non consente un preciso controllo spatiotemporale delle lesioni e quindi è difficile studiare i processi cellulari e molecolari coinvolti nella riparazione del rene. Per ovviare a questa limitazione, questo lavoro presenta un metodo attraverso il quale, in contrasto con l'approccio gentamicinico, una specifica Proteina Fuorescente Verde (GFP) -exIl segmento del nefrone premendo può essere fotografato mediante una luce laser violetta (405 nm). Questo nuovo modello di AKI offre molti vantaggi rispetto agli altri metodi di lesioni epiteliali. I suoi principali vantaggi sono la capacità di "comporre" il livello di lesioni e il preciso controllo spatiotemporale nel robusto modello animale in vivo . Questo nuovo metodo ha il potenziale per aumentare in modo significativo il livello di comprensione dei meccanismi di lesioni renali e di riparazione.
Introduction
La lesione acuta del rene (AKI) 1 , 2 , che può essere chiamata anche insufficienza renale acuta, è ampiamente definita come improvvisa compromissione della funzione renale 3 . Mentre il livello di comprensione di questa condizione è stato notevolmente migliorato nel corso degli anni, i tassi di morbilità e mortalità sono rimasti alti 1 , 2 . Il trattamento attuale per questa condizione è per lo più sostenuto, dato che i risultati di più studi clinici della terapia farmacologica sono stati negativi 4 , 5 . Il rene è unico in quanto ha la capacità di ripararsi. Pertanto, la terapia di supporto dopo una diagnosi precoce dell'AKI è il modo migliore per limitare la morbilità 6 . Tuttavia, è difficile rilevare AKI presto, e il tasso di mortalità è un 50-80% incredibile per coloro che necessitano di dialisi 5. Con la capacità dei reni di ripararsi e la mancanza di opzioni di trattamento per questa condizione, è importante sviluppare metodi per migliorare questo processo di rigenerazione dei nefroni.
Sono stati utilizzati molti modelli diversi per la ricerca AKI che include diversi agenti di lesioni e modelli animali. In termini di agenti di danno renale, la gentamicina antibiotica aminoglicosidica è stata utilizzata come agente nefrotossico che porta all'AKI 7 , 8 . Tuttavia, diversi gruppi hanno riscontrato che il trattamento con gentamicina è letale per l'embrione zebrafish 9 . Provoca danni tubolari troppo gravi per il recupero degli embrioni, rendendo difficile lo studio della rigenerazione senza alcun tipo di intervento. I modelli mammiferi, come il topo e il topo, sono considerati anche preziosi, ma devono affrontare molte limitazioni durante lo studio dell'AK. Forse il principale svantaggio dei modelli di roditori è la difficoltà di visuaDimagrendo il rene del roditore e determinando così i precisi processi spatiotemporali che portano alla morte epiteliale e alla riparazione.
Johnson et al. Hanno riportato una tecnica basata sull'ablazione laser per indurre lesioni acute del rene negli zebrafish embrionali e larvali 9 . Usavano l'ablazione laser pulsata per danneggiare il rene dopo un'iniezione intramuscolare con coniugati di dextran. La fluorescenza dei coniugati di dextran consente la visualizzazione dei danni e la rigenerazione nell'epitelio tubulare 9 . Questo modello supera le due limitazioni di cui sopra, ma non consente livelli di lesioni graduati e è difficile da svolgere su grandi gruppi arbitrari di cellule.
Il nuovo modello di zebrafish basato sull'ablazione laser di AKI qui descritto affronta tutte le limitazioni di cui sopra. Il rene pronebrofico in zebrafish larvale è un organo maturo e funzionante che contiene segmenti analoghi ai mammiferiPhron, inclusi un tubo glomerulus, prossimale e distale e un condotto di raccolta 10 . Le larve di zebrafish sono anche otticamente trasparenti, rendendo possibile osservare il rene attraverso tecniche di fluorescenza. Così, i pesci zebra sono un prezioso modello in vivo di AKI e il rene pronoferico larvale (5-12 giorni dopo la fecondazione (dpf)) può essere utilizzato per studiare i processi cellulari e molecolari coinvolti in lesioni renali e riparazioni.
Questo documento presenta un metodo attraverso il quale possono essere fotoablati specifici segmenti nefronici che esprimono GFP (Green Fluorescent Protein), utilizzando una luce laser violetta (405 nm) a basso consumo energetico (rispetto ad un impulso laser). La fluorescenza GFP consente di targetizzare un gruppo di cellule, rendendo visibili le modifiche attraverso l'osservazione della fotopolimerizzazione di GFP. Inoltre, GFP (assorbendo la luce viola) serve come un dispersore energetico per potenziare il danno nelle cellule renali che esprimono GFP. Time-lapse microsLa copia può quindi essere utilizzata per studiare il processo di riparazione. Gli studi hanno trovato la proliferazione cellulare, la migrazione cellulare e la metaplasia delle cellule 11 , 12 , 13 a tutti i processi potenziali che possono svolgere un ruolo importante nella riparazione del rene. Tuttavia, l'importanza relativa di questi processi e i dettagli della loro interazione è stata difficile da scoprire a causa delle limitazioni dei modelli esistenti di AKI. Utilizzando questo nuovo approccio, è stato possibile dimostrare che la migrazione delle cellule gioca un ruolo centrale nella riparazione del rene dopo lesioni acute 14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Va notato che la potenza laser totale varia tra i sistemi. Tuttavia, l'utilizzo di percentuale di fotopolimerizzazione GFP consente una lettura dell'energia totale erogata al rene fluorescente, indipendente dalla variazione della potenza laser e compensata dalla lunghezza dell'esposizione. Tenga presente, tuttavia, che la risposta di diversi tessuti a questo metodo di fotoablazione varia. Anche durante la maturazione del rene, è significativamente più difficile ottenere una riduzione del 50% della fluoresc…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il dottor Iain Drummond e il dottor Vladimir Korzh per la condivisione di linee transgeniche GFP del rene. Vorremmo anche ringraziare NYITCOM per fornire le risorse necessarie per condurre questo lavoro. Questo studio è stato in parte sostenuto da sovvenzioni: K08DK082782, R03DK097443 (NIH), e HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Petri Dishes, 35 x 10mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4,2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
Referencias
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
