Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra
Summary
Este protocolo descreve análises histológicas dos fígados de larvas de peixe-zebra que foram tratadas com etanol a 2% durante 24 h. Tal tratamento com etanol agudo resulta em esteatose hepática e inchaço da vasculatura hepática.
Abstract
Doença hepática alcoólica (ALD) refere-se a danos ao fígado devido ao abuso de álcool agudo ou crônico. É uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionadas ao álcool e afeta mais de 2 milhões de pessoas nos Estados Unidos. Uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à lesão hepática induzida pelo álcool é crucial para o desenvolvimento de tratamento eficaz para a ALD. As larvas de peixe-zebra exibem esteatose hepática e fibrogênese após apenas 24 horas de exposição a etanol a 2%, tornando-as úteis para o estudo da lesão hepática alcoólica aguda. Este trabalho descreve o procedimento para tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra e mostra que causa esteatose e inchaço dos vasos sanguíneos hepáticos. Um protocolo detalhado para hematoxilina e Eosina (H & E) coloração que é otimizado para a análise histológica do zebrafish larval do fígado, também é descrito. A coloração de H & E tem várias vantagens únicas em relação à imunofluorescência,Er células e componentes extracelulares simultaneamente e pode facilmente detectar lesão hepática, como esteatose e fibrose. Dado o uso crescente de peixe-zebra na modelagem de toxinas e lesões hepáticas induzidas por vírus, bem como doenças hepáticas hereditárias, este protocolo serve de referência para as análises histológicas realizadas em todos estes estudos.
Introduction
A doença hepática alcoólica (ALD), que é causada pelo consumo excessivo de álcool, é uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionadas ao álcool. Nos Estados Unidos, quase metade das mortes por doença hepática envolve álcool 1 , e a ALD é responsável por quase 1 em cada 3 transplantes de fígado 2 . ALD tem um amplo espectro. A esteatose, que se caracteriza pelo excesso de acumulação de lípidos nos hepatócitos, ocorre no estágio inicial de consumo excessivo de álcool e é reversível após a cessação do uso de álcool. Sob a influência de fatores genéticos e ambientais ea ingestão contínua de álcool, a esteatose hepática pode evoluir para hepatite alcoólica e, eventualmente, cirrose 3 . Estudos usando os modelos de ALD de roedores forneceram insights substanciais sobre a doença, mas eles têm limitações (revisado na referência 3 ). A alimentação oral de uma dieta com álcool só causa esteatose em roedores 4 , </ Sup> 5 . O desenvolvimento de inflamação e fibrose requer um segundo insulto 6 , 7 ou infusão intragástrica crônica, que é invasiva e tecnicamente desafiadora 8,9 . O tele-peixe-zebra também desenvolve lesão hepática em resposta ao tratamento crônico e álcool agudo 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Em particular, o peixe-zebra larval representa um organismo modelo complementar atractivo no qual se estuda a lesão hepática alcoólica aguda 10 , 11 , 13 , 15 . O fígado zebrafish é funcional e produz enzimas-chave para o metabolismo de etanol por 4 dias(Dpf) 13,16,17. O etanol pode ser adicionado diretamente à água ea exposição a etanol a 2% por 24 h é suficiente para induzir esteatose hepática e respostas fibrogênicas em larvas de peixe-zebra 13,15.
Tem sido relatado que o tratamento com etanol a 2% durante 24 horas resultou numa concentração de etanol tecidual de 80 mM em larvas de peixe-zebra 13 . Outros demonstraram que as larvas toleram esta concentração e que os fenotipos do fígado observados nos animais tratados são específicos da exposição ao etanol 11 , 13 , 15 , 18 . No entanto, como 80 mM é quase letal em seres humanos 19 , é importante avaliar a histologia do fígado do zebrafish tratado com etanol e deteImportância fisiológica para os seres humanos.
O rápido desenvolvimento externo e translucência das larvas de peixe-zebra permitem caracterizar a ação do álcool no fígado em tempo real e em amostras fixas. A disponibilidade de linhas transgênicas fluorescentes específicas de células e os recentes avanços na microscopia confocal facilitam o estudo de como diferentes tipos de células hepáticas modificam sua morfologia e comportamento em resposta ao tratamento agudo com etanol 11,15. No entanto, a imagem confocal do peixe-zebra transgénico fluorescente não pode substituir completamente a coloração com Hematoxilina e Eosina (H & E) quando se estuda a histologia do fígado. A marcação de todos os tipos de células hepáticas ao mesmo tempo utilizando peixes-zebra transgênicos requer a geração de linhas transgênicas individuais, cada uma rotulando um tipo de célula hepática com um fluoróforo único. A introdução de diferentes fundos transgênicos no mesmo peixe requerG gerações múltiplas, o que é demorado e oneroso. É necessária uma imunofluorescência adicional para detectar os componentes da matriz extracelular. A coloração de H & E, por outro lado, rotula simultaneamente todos os tipos de células hepáticas e componentes de matriz extracelular, proporcionando assim uma visão geral do fígado 20 . Além disso, revela prontamente várias características histopatológicas de doenças hepáticas, tais como morte de hepatócitos, esteatose e fibrose. Embora H & E é uma mancha de rotina na histologia do fígado de mamíferos, não é comumente usado na pesquisa de fígado zebrafish, eo protocolo é menos bem estabelecida.
Este trabalho descreve um protocolo para tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra e para as análises histológicas de seguimento com coloração de H & E. O protocolo de coloração de H & E pode ser usado em todos os estudos de desenvolvimento e função do fígado. Além disso, as seções de parafina podem ser usadas para imuno-histoquímica, bem como para outrasIns na patologia hepática, incluindo a mancha tricrômica, mancha reticulina, etc.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo atual descreve um procedimento detalhado para tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra e as análises histopatológicas subsequentes com coloração de H & E. O tratamento agudo com etanol deve ser realizado não antes de 96 h após a fecundação, pois esta é a fase em que o fígado zebrafish começa a expressar enzimas metabolizadoras de álcool 13 . 2% de etanol é a dose máxima que as larvas podem tolerar 13 , 1…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Dra. Katy Murray no Zebrafish International Resource Center; Dr. Stacey Huppert e Kari Huppert no CCHMC, pelos seus conselhos úteis sobre o protocolo; E serviço veterinário CCHMC, para o cuidado com peixes. Este trabalho foi apoiado pelo NIH subvenção R00AA020514 e uma bolsa de investigação do Centro de Genómica Pediátrica no CCHMC (para CY). Foi também apoio em parte pelo NIH concessão P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) do Centro de Pesquisa de Doenças Digestivas Core em Cincinnati.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
Referencias
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