Здесь мы описываем подготовку жизнеспособных сегментов желудочков у взрослых мышей и их использование для записи о потенциальных потенциальных возможностях электродов. Эти многоклеточные препараты обеспечивают сохраненную in vivo структуру ткани, что делает их ценной моделью для электрофизиологических и фармакологических исследований in vitro .
Мышечные кардиомиоциты широко используются для исследований физиологии сердца и новых терапевтических стратегий in vitro . Однако многоклеточные препараты диссоциированных кардиомиоцитов не являются репрезентативными для комплексной in vivo структуры кардиомиоцитов, немиоцитов и внеклеточного матрикса, что влияет как на механические, так и на электрофизиологические свойства сердца. Здесь мы описываем методику подготовки жизнеспособных желудочковых срезов взрослых мышечных сердец с сохраненной структурой, подобной ткани in vivo , и демонстрируем их пригодность для электрофизиологических записей. После удаления сердца желудочки отделяются от предсердий, перфузируются бескислотным раствором Ca 2+, содержащим 2,3-бутанионный моноксим, и внедряют в 4% низкоплавкий агарозный блок. Блок размещен на микротоме с вибрирующим лезвием, а кусочки ткани толщиной 150-400 мкм подготовлены, сохраняя частоту вибрацииЧастота лезвия на 60-70 Гц и перемещение лезвия вперед как можно медленнее. Толщина срезов зависит от дальнейшего применения. Ломтики хранятся в ледяном растворе Tyrode с 0,9 мМ Ca 2+ и 2,3-бутандионмоноксимом (BDM) в течение 30 мин. Затем срезы переносят в DMEM на 37 ° C в течение 30 минут для промывки BDM. Ломтики могут использоваться для электрофизиологических исследований с острыми электродами или микроэлектронными массивами, для измерения силы для анализа сократительной функции или для исследования взаимодействия трансформированных стволовых клеток-кардиомиоцитов и ткани хозяина. Для резких записей электродов срез помещают в чашку для культивирования клеток размером 3 см на нагревательной пластине перевернутого микроскопа. Лоскут стимулируется однополярным электродом, а потенциал внутриклеточного действия кардиомиоцитов внутри среза регистрируется острым стеклянным электродом.
Тонкие срезы ткани часто использовались в фундаментальной науке, так как в 1966 году Ямамот и Маклвейн показали, что электрическая активность срезов мозга поддерживается in vitro 1 . С тех пор электрофизиологические и фармакологические исследования проводились на срезах из мозга 2 , печени 3 , легкого 4 и ткани миокарда 5 , 6 , 7 . Первые записи патч-зажима в желудочковых срезах из сердец новорожденных крыс были описаны в 1990 году 8 , но эта техника в течение некоторого времени зашла в небытие. Спустя более десятилетия наша группа разработала новый метод подготовки мышиных эмбриональных 9 , неонатальных 10 и взрослых 11 срезов сердца. Эти жизнеспособные срезы ткани могут использоваться для острых экспериментов (взрослый срезS можно культивировать в течение нескольких часов) или краткосрочные эксперименты с культурой (зародыши и новорожденные срезы можно культивировать в течение нескольких дней). Ломтики демонстрируют in vivo, как электрофизиологические характеристики, и гомогенный разброс возбуждения, оцениваемый с помощью резкого потенциала действия электрода и записей микроэлектродов. Благодаря своей «двумерной» морфологии они позволяют осуществлять прямой доступ к регистрирующим электродам во все области желудочка, что делает их интересным инструментом для электрофизиологических исследований и создает новые экспериментальные варианты по сравнению с перентованными сердцами Лангендорфа. Реакция лекарственного средства срезов на блокаторы ионных каналов, такие как верапамил (L-тип Ca 2+ -канальный блокатор), лидокаин (блокатор Na + -канала), 4-аминопиридин (неселективный зависимый от напряжения K + -канальный блокатор) и линопирдин (KCNQ K + -канальный блокатор) 9 , 11 </suP> соответствует известным эффектам на диссоциированных кардиомиоцитах. Измерения изометрической силы выявили положительную частотную зависимость силы и сильно предложили неповрежденную сократительную функцию 10 . Эти данные показали, что мышиные желудочковые срезы пригодны в качестве модели ткани in vitro для физиологических и фармакологических исследований. Кроме того, желудочковые срезы сердечников-реципиентов в сочетании с резкой записью электродов оказались очень полезным инструментом для характеристики электрической и механической интеграции, а также созревания трансплантированных эмбриональных карциномиоцитов 12 , 13 , 14 и стволовых клеток.
Таким образом, желудочковые срезы представляют собой ценную и хорошо устанавливаемую многоклеточную модель ткани и должны считаться комплементарными диссоциированным кардиомиоцитам и сердечно-перфузионным сердцам ЛангендорфаВ кардиоваскулярных исследованиях, с основным преимуществом обеспечения структуры in vivo как ткани (в отличие от диссоциированных клеток), а также прямого доступа к измерительным технологиям, таким как резкие записи электродов во все области сердца (в отличие от цельных препаратов сердца).
Желудочковые срезы позволяют проводить электрофизиологические, фармакологические и механические исследования с сохраненной структурой ткани, подобной ткани in vivo , и прямым доступом к измерительной технологии во все области сердца. Свойства потенциала физиологического действи?…
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем поддержку, оказываемую семинарами и животным учреждением Института нейрофизиологии. Эта работа была поддержана Уолтером и Маргой Болл-Стифтунгом, Кёльном Форчунтом и Немецкой школой для Герцфоршунга.
Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
Preparation table | self made | ||
Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |