La perfusión como un método para la visualización vascular<em> Ambystoma mexicanum</em
Summary
Usando una técnica lipofílica de tinción de perclorato de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina (DiI), Ambystoma mexicanum puede someterse a perfusión vascular para permitir una fácil visualización de la vasculatura.
Abstract
Las técnicas de perfusión se han utilizado durante siglos para visualizar la circulación de los tejidos. Axolotl (Ambystoma mexicanum) es una especie de salamandra que ha surgido como un modelo esencial para los estudios de regeneración. Poco se sabe acerca de cómo se produce la revascularización en el contexto de la regeneración en estos animales. Aquí presentamos un método simple para la visualización de la vasculatura en axolotl vía perfusión de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI). DiI es un colorante de carbocianina lipofílico que se inserta en la membrana plasmática de las células endoteliales instantáneamente. La perfusión se realiza usando una bomba peristáltica de tal manera que DiI entra en la circulación a través de la aorta. Durante la perfusión, el colorante fluye a través de los vasos sanguíneos del axolotl e incorpora en la bicapa lipídica de las células endoteliales vasculares al contacto. El procedimiento de perfusión dura aproximadamente una hora para un axolotl de ocho pulgadas. Inmediatamente después de la perfusión,Th DiI, el axolotl se puede visualizar con un microscopio confocal fluorescente. El DiI emite luz en el rango naranja-rojo cuando se excita con un filtro fluorescente verde. Este procedimiento de perfusión DiI puede usarse para visualizar la estructura vascular de los axolotes o para demostrar patrones de revascularización en tejidos regeneradores.
Introduction
La visualización de la vasculatura desempeña un papel vital en la comprensión de la estructura y función de los organismos a través de muchas especies. A partir del siglo XVI con Leonardo da Vinci, se han estudiado modelos y representaciones gráficas de la circulación 1 . Usando ceras y moldes de caucho, los tejidos fueron perfundidos para crear modelos tridimensionales de la vasculatura, lo que permitió el estudio de la organogénesis y la patogénesis [ 1 , 2] . Las resinas y las ceras se colorearon con tintes tales como tinta India o rojo carmín para permitir su fácil visualización 1 , 2 . Sin embargo, estas técnicas causaron muchos problemas debido a que sus altas viscosidades impidieron la perfusión total del tejido de interés 1 . A medida que el campo se hizo más sofisticado, el uso de microscopios confocales y electrónicos entró en juego, moviendo la técnica de perfusión Lejos de los moldes y hacia perfusiones líquidas de la vasculatura, algunas de las cuales permitieron la perfusión y la imagen de los vasos sanguíneos sin destruir el tejido inicial 3 . DiI, un colorante de carbocianina fluorescente, es una de tales manchas que permite la perfusión de animales sin dañar el tejido vascular.
Los colorantes de carbocianina son tintes lipófilos que se incorporan en las membranas celulares al contacto. Estos colorantes permiten una tinción fácil e instantánea de las células endoteliales vasculares, que pueden ser vistas después bajo un microscopio confocal fluorescente. DiI se mueve a través de la difusión lateral en la membrana lipídica de las células, como se muestra en el etiquetado y rastreo de las neuronas [ 4] . Quımicamente, las dos cadenas alquılicas de DiI dan al tinte su alta afinidad por las membranas celulares, mientras que dos anillos conjugados de un fluorocromo que es responsable de emitir una longitud de onda roja cuando son excitados por filtros de luz fluorescente verde> 4. DiI se ha utilizado en muchas capacidades, incluyendo el etiquetado exitoso de la membrana plasmática y marcaje anterógrado y retrógrado en las neuronas [ 5 , 6] . DiI se ha utilizado previamente en los protocolos de perfusión, mientras que la visualización de la vasculatura de ratones [ 7] .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) son salamandras que viven exclusivamente en lagos salobres cerca de la Ciudad de México, México. Estos animales se han convertido en un modelo importante para la comprensión de los procesos regenerativos, ya que pueden regenerar los miembros completos, la cola (incluyendo el cordón nervioso), las porciones del corazón y otros órganos internos y las porciones del ojo como adultos 8 , 9 . Además, con la reciente aplicación de herramientas genéticas en axolotls, una visión sin precedentes en las moléculas y las células que conducen estos procesos es ahora posible 8 . El exitoso regeneRación de una extremidad entera requiere un proceso extensivo de la revascularización, que puede desempeñar un papel significativo en la regeneración más allá de las funciones tradicionales de los vasos sanguíneos en proporcionar el oxígeno y los alimentos. Entender la revascularización en el contexto de la regeneración tisular es imperativo. Axolotl vasos sanguíneos han sido previamente visualizados con India Ink, y si bien los resultados fueron intrigantes, este proceso no ha sido revisado en las décadas posteriores [ 10] . Se intentó adaptar un protocolo de perfusión DII desarrollado para su uso en mamíferos para permitir una completa perfusión y visualización de la axolotl vascular 7 . Este protocolo describe las medidas tomadas para perfusar con éxito y posteriormente visualizar la circulación del axolotl con una técnica de tinción DII. Este procedimiento permitirá una visualización precisa de los vasos sanguíneos patentes en tejidos homeostáticos, así como en tejidos regeneradores, y proporciona un nuevo método para la visualizaciónN y análisis del proceso de revascularización en axolotl.
Protocol
Representative Results
Discussion
La visualización de la vasculatura del axolotl puede lograrse con éxito mediante la perfusión con el colorante de carbocianina lipófilo, DiI. En este estudio se describe un nuevo protocolo para la perfusión del axolotl con DiI utilizando una bomba peristáltica. También se muestra la posterior visualización de la vasculatura axolotl utilizando un microscopio confocal fluorescente. Este protocolo fue una adaptación del protocolo de perfusión DiI de roedor observado en Li et al. 7…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Brigham & Women's Hospital y la March of Dimes. Los autores desean agradecer a todos los miembros del Whited Lab por su apoyo y asesoramiento.
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
Referencias
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- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
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