Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari
Summary
Questo lavoro dimostra un nuovo approccio per valutare la proliferazione, la differenziazione e il potenziale di formazione delle vascelle di cellule staminali endoteliali (VESCs) attraverso il trapianto di grassi mammarie, seguito da una preparazione del tessuto a tutto sesto per l'osservazione microscopica. Viene inoltre presentata una strategia di tracciamento delle linee per indagare il comportamento dei VESC in vivo .
Abstract
Le cellule endoteliali (ECs) costituiscono i fondamenti fondamentali dell'architettura vascolare e mediano la crescita vascolare e il rimodellamento per garantire lo sviluppo adeguato dei vasi e l'omeostasi. Tuttavia, gli studi sulla gerarchia delle linee endoteliali rimangono inafferrabili a causa della mancanza di strumenti per accedere e di valutare direttamente il loro comportamento in vivo . Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un nuovo modello di tessuto per studiare l'angiogenesi usando il tampone di grasso mammario. La ghiandola mammaria si sviluppa soprattutto nelle fasi postnatali, tra cui la pubertà e la gravidanza, durante la quale la robusta proliferazione epiteliale è accompagnata da un'ampia rimodellamento vascolare. I rilievi di grasso mammario forniscono spazio, matrice e ricchi stimoli angiogenici dal crescente epitelio mammario. Inoltre, i tamponi di grasso mammario sono situati al di fuori della cavità peritoneale, rendendoli un luogo di innesto facilmente accessibile per valutare il potenziale angiogenico delle cellule esogene. Questo lavoro descrive anche un efficeNt tracciando l'approccio utilizzando topi reporter fluorescenti per specificare in modo specifico la popolazione mirata di cellule staminali endoteliali vascolari (VESCs) in vivo . Questo metodo di tracciamento delle linee, accoppiato con la successiva microscopia integrale a tessuto, consente la visualizzazione diretta di cellule mirate e dei loro discendenti, attraverso i quali la capacità di proliferazione può essere quantificata e l'impegno di differenziazione può essere suddiviso. Utilizzando questi metodi, una popolazione di recettori Bipotenti di proteine C (Procr) che esprimono VESCs è stata recentemente identificata in più sistemi vascolari. Procr + VESCs, che danno origine a nuove EC e periciti, contribuiscono attivamente all'angiogenesi durante lo sviluppo, l'omeostasi e la riparazione degli infortuni. Nel complesso, questo manoscritto descrive un nuovo trapianto di tessuto grasso mammario e tecniche di tracciamento in linea vivo che possono essere utilizzate per valutare le proprietà delle cellule staminali dei VESCs.
Introduction
Durante lo sviluppo e l'omeostasi, la crescita vascolare e il rimodellamento si svolgono fedelmente in conformità con la crescita e la riparazione dell'organo. L'angiogenesi descrive la generazione di nuove vasi da vasi sanguigni preesistenti ed è considerata una forza importante che medierà questi cambiamenti vascolari dinamici. Ogni vaso sanguigno è interiore rivestito con uno strato di cellule endoteliali (ECs), e sembrano essere il fondamento dell'architettura dei vasi. Per lungo tempo, il meccanismo attraverso il quale è stato rifornito il pool comunitario durante l'omeostasi è rimasto chiaro e sono stati sollevati argomenti su se il fatturato vascolare sia il risultato di una proliferazione maturata della CE o il contributo delle attività delle cellule staminali vascolari / progenitori. A causa della mancanza di prove fisiologiche dirette, l'esistenza e l'identità cellulare delle cellule staminali endoteliali vascolari (VESC) restano comunque controverse.
Uno degli approcci più comuni utilizzati per verificare il comportamento delle cellule staminali è attraverso il trapiantoDelle cellule staminali presenti nei topi riceventi. Questo metodo misura il potenziale di stemma delle cellule staminali candidate in vivo. Il trapianto è stato applicato per lo studio delle cellule staminali del midollo osseo 1 , che hanno contribuito alla definizione delle caratteristiche gerarchiche del sistema ematopoietico 2 . Nel campo endoteliale, una matrice di membrana basale ( ad es., Matrigel) inserita sottocutanea sotto la pelle del fianco è stata un test standard di angiogenesi in vivo utilizzato per affrontare le capacità di formazione delle vasche di EC trapiantate. Metodi sperimentali multipli, compresa la formazione di colonie nei sistemi di coltura 3D e trapianto, hanno suggerito le potenziali popolazioni EC progenitor / VESC 3 , 4 , 5 , 6 . Tuttavia, poiché le EC incorporate nella matrice della membrana basale sono relativamente separateIl tessuto circostante, questo non fornisce l'ambiente di nicchia ottimale richiesto per esplorare pienamente il potenziale angiogenico delle cellule trapiantate. Di conseguenza, le navi formate all'interno della spina a matrice sono prevalentemente capillari e sono funzionalmente inconfondibili.
La ghiandola mammaria si sviluppa postnatale, con la crescita più robusta durante la pubertà e la gravidanza. Alla fase pubertale, l'epitelio mammario subisce un'espansione rapida, per occupare l'intero grasso di grasso mammario, accompagnato dall'efficace rimodellamento delle strutture vascolari circostanti. Pertanto, la ghiandola mammaria offre un eccellente modello per lo studio dell'angiogenesi. Fornisce spazio, matrice e ricchi stimoli angiogenici dal crescente epitelio mammario e quindi è un luogo di innesto ideale per valutare il potenziale angiogenico delle cellule esogene. Inoltre, il tampone di grasso mammario consente ai vasi esogeni formati di integrarsi con il sistema di circolazione dell'ospite, consentendo ulteriori fValutazione non unica e che rappresenta un vantaggio rispetto al trapianto sottocutaneo.
Sebbene i test di coltura in vitro e di trapianto siano un modo efficace per indagare le proprietà di rigenerazione di una popolazione cellulare, è noto che tali saggi possono stimolare la plasticità poiché le cellule vengono tolte dai loro habitat naturali e le modifiche potrebbero essere indotte quando le cellule sono scollegate da Il loro ambiente fisiologico 7 . Pertanto, ottenere l'evidenza diretta in vivo del destino cellulare è l'approccio chiave per favorire la comprensione attuale del comportamento delle popolazioni endoteliali.
La mappatura del destino genetico ( cioè il tracciamento di linee in vivo ) è indispensabile per l'identificazione dei VESC e per l'indagine delle loro proprietà nel sistema corporeo in quanto può rivelare il comportamento delle cellule staminali in vivo nel suo contesto fisiologico e l'effettivo gambo può essere valutato. Lineage traciNg fornisce una dimostrazione diretta della persistenza a lungo termine ( cioè, autoreplicazione) dei VESC candidati e della loro capacità di produrre tipi cellulari per il tessuto di origine ( cioè potenza di differenziazione).
Questo protocollo descrive una nuova tecnica di trapianto di grassi del grasso mammario e un metodo di tracciamento delle linee per osservare la capacità di generazione dei vasi di VESCs. Queste tecniche superano le carenze dei dosaggi attualmente disponibili e forniscono un nuovo modo per valutare in modo ottimale le proprietà delle cellule staminali dei VESCs. Questi approcci sono strumenti efficaci che possono essere utilizzati per valutare le proprietà di comportamento e di formazione delle navi delle popolazioni endoteliali, nonché per determinare la alterazione della potenza delle cellule vascolari all'interno di un ambiente patologico.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dosaggi di angiogenesi rappresentano un buon approccio sperimentale per studiare la dinamica vascolare. La vasculatura retinica del mouse, che si sviluppa dopo la nascita, si è dimostrata un modello attraente per studiare l'angiogenesi 12 . Nonostante sia relativamente accessibile, la manipolazione effettiva all'interno del letto vascolare della retina è piuttosto difficile. Finora, il trapianto in vivo meglio descritto è stato il test di spina, che racchiude celle all'i…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation della Cina (31530045 e 31371500 a YAZ, 31401245 a QCY), dal Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2014CB964800), dall'Accademia Cinese delle Scienze (XDB19000000 a YAZ) e dai cinesi Società di Biologia cellulare (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
Referencias
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