إعداد على نطاق متوسط من<em> ذبابة الفاكهة</em> مقتطفات الجنين للتجارب بروتيوميك
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نهج مباشر وغير مكلفة لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط (0.5-1 ز) وإعداد مقتطفات البروتين التي يمكن استخدامها في التطبيقات البروتين المصب، مثل تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس ).
Abstract
أصبح تحليل التفاعلات البروتينية البروتين نهجا لا غنى عنه لدراسة العمليات والآليات البيولوجية، مثل إشارات الخلية، وتطوير الكائن الحي، والمرض. وغالبا ما يكون من المرغوب فيه للحصول على معلومات مؤشر أسعار المنتجين باستخدام في الجسم الحي المواد، للحصول على وجهة نظر الأكثر طبيعية وغير منحازة من شبكات التفاعل. ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر هو منصة ممتازة لدراسة مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي ، ويتيح نفسه لنهج واضحة لعزل المواد للتجارب البيوكيميائية. على وجه الخصوص، تمثل الأجنة ذبابة الفاكهة نوع مناسب من الأنسجة لدراسة مؤشر أسعار المنتجين، ويرجع ذلك إلى سهولة جمع الحيوانات في هذه المرحلة التنموية وحقيقة أن غالبية البروتينات وأعرب في التطور الجنيني، وبالتالي توفير بيئة ذات صلة للكشف عن معظم مؤشر أسعار المنتجين. هنا نقدم بروتوكول لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط (0.5-1 ز)، وهو مبلغ مثالي لمجموعة واسعة منتطبيقات البروتين، بما في ذلك تحليل مؤشر أسعار المنتجين من قبل تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس). نحن تصف تصاميمنا ل 1 L و 5 L أقفاص لمجموعات الجنين التي يمكن أن تكون بسهولة وتكلفة اقامة في أي مختبر. ونحن نقدم أيضا بروتوكول عام لجمع الجنين واستخراج البروتين لتوليد ليسيتس التي يمكن استخدامها مباشرة في التطبيقات المصب مثل أب-مس. هدفنا هو توفير وسيلة متاحة لجميع الباحثين لتنفيذ تحليلات مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي .
Introduction
الشاشات الجينية، ومؤخرا، النهج الجينومية ثورة في دراسة الوظائف البيولوجية. ومع ذلك، يتم ترميز المعلومات الخلوية الهامة في البروتينات ومجموعتها من الشركاء المتفاعلين. في حين أن شاشات المعدل الجيني التقليدية يمكن تحديد مكونات مسار الحد من معدل واستعادة التفاعلات غير المباشرة، وقوة النهج البروتين يكمن في قدرتها على تحديد شبكات التفاعل الفوري الكامل للبروتينات ذات الاهتمام. وبالتالي، فإن بروتيوميكس طريقة متعامدة قيمة لدراسة النظم البيولوجية، ويكمل علم الجينوم، ترانسكريبتوميكس، والشاشات الوراثية التقليدية. وقد أثبتت تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس) أن يكون نهجا قويا لدراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي) في بيئتهم الأصلية في الخلايا والأنسجة 1 ، 2 . وتسمح هذه الطريقة بتحديد التفاعلات المباشرة أو غير المباشرة في تطوير معينمراحل أو سياقات الأنسجة، وقد استخدمت بنجاح لتحديد متعددة مؤشرات الأداء القياسية الرواية في مجموعة متنوعة من المسارات التنموية (استعرض في المرجع 1 ). على الرغم من النجاح الذي لا جدال فيه لدراسات مؤشر أسعار المنتجين، معظمها قد نفذت في الخلايا المستزرعة، حيث تم الإفراط في التعبير عن البروتينات "الطعم" من الفائدة. هناك نوعان من القضايا مع دراسة مؤشر أسعار المنتجين في زراعة الخلايا: أولا، قد لا يوفر خط خلية محددة مجموعة كاملة من التفاعلات بسبب عدم التعبير عن بعض البروتينات. ثانيا، أوفيركسريسيون عالية عادة ما تستخدم في مثل هذه التحليلات قد تؤدي إلى القطع الأثرية مثل بروتين ميسفولدينغ أو تحديد تفاعلات إيجابية كاذبة.
كل من هذه القيود يمكن التغلب عليها من خلال تحليل مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي . وهناك خطوة محدودة في مثل هذه التجارب هو توافر المواد انطلاق لتنقية المجمعات البروتين. وقد استخدمت منذ فترة طويلة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر كنموذج لتحليل وظيفيوقد ثبت مؤخرا أنه نظام ممتاز لدراسة مؤشرات أسعار المنتجين في الجسم الحي . يمثل تجنين ذبابة الفاكهة نوع الأنسجة جذابة بشكل خاص لدراسة مؤشر أسعار المنتجين، لأن الأجنة يمكن جمعها بسهولة بكميات كبيرة، وأيضا لأن معظم الجينات (> 88٪) يتم التعبير عن مسار التطور الجنيني، وبالتالي توفير غنية في بيئة الجسم الحي للكشف عن ذات الصلة مؤشر أسعار المنتجين 3 .
تقليديا، والدراسات البيوكيميائية في الذباب تستخدم جدا على نطاق واسع مجموعات الجنين (100-150 ز)، مثل تلك اللازمة لتنقية ليسيتس النسخي وظيفية 4 ، 5 . الدراسات السابقة أب- مس في ذبابة الفاكهة تحتاج أيضا كميات كبيرة من الأجنة (5-10 ز)، لأنها اعتمدت على نهج تنقية من خطوتين مثل جنبا إلى جنب تنقية تقارب (تاب)، مع فقدان المرتبطة من المواد في كل خطوة 6 . كبير أمونتيسي من المواد البدء في إنشاء مجموعات الجنين في أقفاص سكانية كبيرة، والتي يمكن أن تكون على حد سواء باهظة الثمن (عند شراؤها تجاريا) وتستغرق وقتا طويلا للحفاظ على ونظيفة 7 ، 8 ، 9 .
التطورات الأخيرة في تطوير نهج تنقية تقارب خطوة واحدة، فضلا عن حساسية متزايدة من مطياف الكتلة، وخفضت الكمية اللازمة من المواد بدءا من قبل حجم من الحجم. باستخدام علامات مثل الببتيد ستريبتافيدين ملزم (سبب) أو بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) والبدء من أقل من 1 غرام من الأجنة، فمن الممكن لعزل كميات من البروتين الطعم والتفاعل المكونات التي ستكون كافية لتحديد من قبل مطياف الكتلة 10 ، 11 .
الهدف من البروتوكول المعروضة هنا هو مساعدة الباحثين أوفيركولي حاجز ينظر إلى التحليل البيوكيميائية من مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي . تحقيقا لهذه الغاية، ونحن نقدم إجراء بسيط وغير مكلفة لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط (0.5-1 ز)، تليها خطوة واحدة إعداد مقتطفات البروتين كامل الخلية التي هي مناسبة لتحليل لاحق من قبل أب-مس أو نهج أخرى . يعتمد أسلوبنا على استخدام 1-L أو 5-L أقفاص السكان حسب الطلب التي يمكن أن تنتج بسهولة من قبل أي مختبر. وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة ظروف الاستخراج المعروضة هنا في العديد من الدراسات، سواء في الخلايا المستزرعة وفي الجسم الحي 10 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 .
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول المقدمة هنا هو إجراء بسيط وعمومي لإعداد أقفاص السكان ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط، وجعل مقتطفات البروتين خلية كاملة من الأجنة. ويمكن استخدام مقتطفات الناتجة في مجموعة متنوعة من التطبيقات المصب، مثل تنقية المجمعات البروتين على راتنجات تقارب. فمن الأهم…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون أعضاء مختبر فيراكسا على تعليقات مفيدة حول المخطوطة واقتراحات لتحسين البروتوكول. تم دعم أف من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM105813 و NS096402. وقد دعم لي من جامعة ماساتشوستس بوسطن سانوفي جنزيمي الدكتوراه زمالة.
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
Referencias
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genética. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genética. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O’Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
