دراسة لتفاعلات البروتين البروتين في البحوث أوتوفاجي
Summary
المعروضة هنا تقنيات بحوث التفاعل القائم على جسم البروتين-بروتين اثنين: الفلورة وإيمونوبريسيبيتيشن. وتصلح هذه التقنيات لدراسة التفاعلات الفيزيائية بين البروتينات لاكتشاف عناصر جديدة من مسارات الإشارات الخلوية وفهم ديناميات البروتين.
Abstract
تفاعلات البروتين البروتين مهمان للشلالات فهم الإشارات الخلوية وتحديد مسار الرواية عناصر وديناميات البروتين. تتطلب معظم الأنشطة الخلوية التفاعلات الفيزيائية بين البروتينات. لتحليل ورسم خريطة لهذه التفاعلات، وضعت مختلف التقنيات التجريبية، فضلا عن أدوات المعلوماتية الحيوية. أوتوفاجي هو هاتف خلوي إعادة تدوير إليه تسمح للخلايا للتعامل مع الضغوطات المختلفة، بما في ذلك الحرمان المغذيات والمواد الكيميائية، ونقص. من أجل فهم أفضل لإحداث إشارات متعلقة أوتوفاجي واكتشاف العوامل الرواية التي تنظم البروتين المجمعات في أوتوفاجي، نحن أداء شاشات التفاعل البروتين-بروتين. التحقق من هذه النتائج الفرز يتطلب استخدام الفلورة والتقنيات إيمونوبريسيبيتيشن. في هذا النظام، تم اختبار محددة تتعلق أوتوفاجي البروتين-بروتين التفاعلات التي اكتشفنا في Neuro2A (N2A) وخطوط الخلايا HEK293T. وأوضح تفاصيل الإجراءات التقنية المستخدمة في هذه الورقة تجربة تصور.
Introduction
ماكرووتوفاجي (أوتوفاجي، هنا) هو إليه إجهاد خلوية التي تتميز بعزل معظم السيتوبلازم والبروتينات والعضيات في غشاء مزدوج حويصلات تسمى الحويصلات أوتوفاجيك. من خلال انصهار الطبقة الخارجية من الغشاء مزدوجة، الحويصلات أوتوفاجيك وحمولتها يتم تسليمها إلى lysosomes والمتدهورة فيه1. أوتوفاجي يحدث في تدني المستويات القاعدية في جميع أنواع الخلايا وفي جميع الكائنات الحية، يؤدون وظائف التماثل الساكن مثل تدهور البروتين ودوران عضية (مثلاً، الميتوكوندريا). تحت الظروف التي تؤدي إلى إجهاد الخلوية، مثل الجوع، أوتوفاجي هو سرعة upregulated ويسمح للخلية للحفاظ على مستويات الطاقة والايض الأساسية1،،من23.
وقد تم استنساخ الجينات أوتوفاجي حوالي 30 من الخميرة ومنتجاتها البروتين عرضت القيام بدور في مراحل مختلفة من عملية أوتوفاجيك، بما في ذلك التنو حويصلة، التوسع، والانصهار حويصلة دخلول/يحلول الراحل، وتردي البضائع 4 , 5-أورثولوجس الأغلبية من هذه الجينات قد حددت وأكدت الدراسات في الكائنات المختلفة الحفاظ على تلك الوظائف الخلوية6. في العقد الماضي أظهرت الدراسات أن عدة متعلقة أوتوفاجي البروتين المجمعات وتفاعلات البروتين البروتين موجودة، وأنها تحكم مسارات أوتوفاجي بطريقة معقدة والتي تسيطر عليها. التقاطعات والنسخ الاحتياطية، والتغذية المرتدة، وآليات feedforward موجودة، وأنها تسمح للخلية بتنسيق أوتوفاجي مع الأحداث الأخرى ذات الصلة (مثل إفراز حويصلية، يحلول نشوء حيوي، اندوسومال الفرز والنقل7، إلخ) في شاشة غير متحيزة اثنين والخميرة هجين استخدام البروتين أوتوفاجي ATG5 كطعم، (ATG5 هو بروتين أوتوفاجي رئيسية المنخرطة في نظام التصريف مثل E2 الذي يتوسط ليبيديشن LC3 في المجاعة الناجمين عن أوتوفاجي)، حددنا “المنشط مستقبلات” ج-كيناز 1 (RACK1؛ GNB2L1) إينتيراكتور قوية و مكون أوتوفاجي رواية8. الأهم من ذلك، أظهرت الشاشة أن التفاعل ATG5-RACK1 لا غنى عنه لتحريض أوتوفاجي من أوتوفاجي الكلاسيكي مستحثات (تثبيطأيوالتجويع و mTOR).
الأساليب المستندة إلى الفلورة تستخدم عادة لرصد تفاعلات البروتين البروتين. هذه التقنيات المستندة أساسا إلى جسم، وتساعد على تصور التفاعلات وتأكيد تعريب الهاتف الخلوي. في هذا الأسلوب، علامة نيون مترافق الأجسام المضادة الخاصة بالبروتينات للفائدة تستخدم عموما لتلوين المحددة. قد يكون المسمى كل البروتين مع الأجسام المضادة بالإضافة إلى الأصباغ الفلورية مختلفة. استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين، يشير إلى وجود تداخل في الإشارات عندما يتم دمج الصور التعريب المشارك من البروتينات تحت المجهر [كنفوكل]. هذا الأسلوب ينطبق على الخلايا أو الأنسجة حتى. تقنيات الفلورة تقديم أدلة حول ديناميات التفاعل، والمساعدة في تحديد حجم وتوزيع البروتين المجمعات، بينما تتبع التغيرات العامة في مورفولوجيا الخلوية تحت ظروف مختلفة9. إيمونوبريسيبيتيشن هي آخر تقنية تستند إلى جسم استخداماً يسمح لتحليل التفاعلات بين إعطاء البروتينات10. باستخدام هذا الأسلوب، البروتينات ذات الاهتمام معزولة من الخلايا أو تستخرج الأنسجة باستخدام أجسام مضادة محددة، أسفر هطول الأمطار البروتينات الموجودة في مجمع أو على اتصال بروتين للفائدة. Co-إيمونوبريسيبيتيشن، حيث يتم الكشف عن البروتين وبه إينتيراكتور المشارك، يكشف ليس فقط بالتفاعل بين البروتينات اثنين، ولكن يمكن قياس قوتها التفاعل تحت ظروف مختلفة11.
ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل التقنيات الرئيسية التي استخدمت لتأكيد وتميز تفاعل ATG5-RACK1 و RACK1-LC3. يتم التركيز على تقنيات الفلورة وإيمونوبريسيبيتيشن، مع التركيز على الخطوات الحاسمة والمزالق للبحث أوتوفاجي، فضلا عن اقتراحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنيات إيمونوبريسيبيتيشن والفلوره ذات أهمية حاسمة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين. على الرغم من أن يشيع استخدام هذه التقنيات اثنين وراسخة، ينبغي النظر عدة معايير لتحديد نوعية التجارب أثناء استخدام هذه التقنيات.
ينبغي أن تكون أجسام أولاً، الأولية المستخدمة في هذه الاختب…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل العلمية والتكنولوجية أبحاث المجلس من تركيا (توبيتاك) 1001 107T153 منحة، جامعة سابانجى. سيب و NMK تدعمها توبيتاك 2211 بدب منحة دراسية لدراسات الدكتوراه.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
Referencias
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
