Purificação do compartimento da membrana retículo endoplasmático associado a degradação de antígenos exógenos em cruz-apresentação
Summary
O método descrito aqui é um novo protocolo de isolamento de vesículas, que permite a purificação dos compartimentos celulares onde os antígenos exógenos são processados pelo retículo endoplasmático associado a degradação em cruz-apresentação.
Abstract
Células dendríticas (DCs) são altamente capazes de processar e apresentar antígenos exógenos interiorizados a classe principal de histocompatibilidade (MHC) moléculas também conhecido como Cruz-apresentação (CP). CP desempenha um papel importante não só na estimulação de ingênuo CD8+ T memória CD8 e células+ T células para infecciosas e imunidade de tumor, mas também na inativação de auto-agente ingênuo T células por células T anergy ou supressão de células T. Embora o mecanismo molecular crítico da CP continua a ser elucidado, acumula evidências indicam que antígenos exógenos são processados através de retículo endoplasmático associado degradação (ERAD) após a exportação do não-clássica endocítica compartimentos. Até recentemente, caracterizações desses compartimentos endocítica limitavam-se porque não havia nenhum marcadores moleculares específicos além de antígenos exógenos. O método descrito aqui é um novo protocolo de isolamento de vesículas, que permite a purificação desses compartimentos endocítica. Usando esta purificada do microsome, nós reconstituído a ERAD, como transporte, ubiquitination e processamento do antígeno exógeno em vitro, sugerindo que o sistema ubiquitina-Proteassoma processado o antígeno exógeno após exportação deste compartimento celular. Este protocolo pode ser mais aplicado a outros tipos de células para esclarecer o mecanismo molecular da CP.
Introduction
O MHC moléculas são expressas na superfície de todas as células nucleadas, com curtos peptídeos antigênicos derivados de antígenos endógenos, que são processados pelo sistema ubiquitina-Proteassoma no citosol1. Após o processamento, peptídeos antigênicos são transportados para o lúmen do retículo endoplasmático (ER) pelo transportador peptídeo TAP. No lúmen do ER, uma série de acompanhantes específicos auxiliar o carregamento do peptide e o dobramento correto do MHC complexo eu. Esta série de moléculas é chamado o complexo peptídeo-carregamento (PLC), indicando que o ER é um compartimento central para peptídeo carregando em cima do MHC eu2. Depois de peptídeo de carregamento, o MHC moléculas são transportadas à superfície da célula e desempenhar um papel fundamental no sistema imune adaptativo como marcadores auto e habilita o CD8+ linfócitos T citotóxicos (CTLs) para detectar células cancerosas ou agentes infecciosos por antigênica peptídeos de proteínas não-auto3.
Em células apresentadoras de (APC), peptídeos antigênicos de antígenos exógenos são também apresentados em MHC eu4,5,6,7,8 através do CP, que é realizada principalmente por DCs9,10,11. CP é essencial tanto para a ativação do ingênuo CD8+ T memória CD8 e células+ T células em anti-infecciosos e anti-tumoral CTLs12,13e na manutenção da tolerância imunológica pela inactivar de auto interino ingênuo T células14,15. O CP desempenha muitos papéis importantes no sistema imune adaptativo, porém os mecanismos moleculares de CP tem ainda que ser descrita em pormenor. Estudos anteriores de CP revelaram que antígenos exógenos foram localizados no pronto-socorro e o endossomo e foram processados por ERAD, sugerindo que antígenos exógenos são transportados desde o endossomo ao pronto-socorro para a ERAD, como processamento e peptídeo carregando16 . No entanto, acumula evidências indicam que o carregamento do peptide do CP é realizado, não no PS, mas sim em compartimentos endocítica não-clássica, que também têm características distintivas do ER (Figura 1)17,18 ,19,20,21. Para evitar a degradação dos precursores de peptídeo antigênico pela alta atividade de aminopeptidase22 no citosol, processamento e peptídeo carregando no CP ocorre na região proximal desses compartimentos endocítica não-clássica (Figura 1). Embora as caracterizações desses compartimentos endocítica são controversas, não há nenhuma molécula de específica existente além de antígenos exógenos neste compartimento.
ERAD é uma via celular, que especificamente remove proteínas misfolded da emergência. Na via da ERAD, misfolded proteínas retrogradely são transportadas através da membrana de ER para o citoplasma e processadas pelo sistema da ubiquitina-Proteassoma23,24,25. Quando as grandes moléculas, tais como proteínas, são transportadas através da bicamada lipídica, essas moléculas passam por um aparato molecular chamado um translocon, tais como o complexo de Sec61 e Derlin complexo em ER26e o complexo de Tom e Tim complexo na mitocôndrias,27. Quando adicionado exogenamente antígenos são transportados através da membrana de ER, eles devem penetrar a bicamada lipídica em complexo com translocons, tais como o complexo de Sec61. O método descrito aqui purificado da vesícula alvo utilizando estas moléculas de membrana-penetrante como marcadores para os compartimentos endocítica.
O método descrito aqui é um novo protocolo de purificação de vesículas usando o DC, como célula linha DC2.428 e biotinilado ovalbumina (bOVA) como um antígeno exógeno. Os compartimentos endocítica foram purificados por streptavidin (SA)-grânulos magnéticos usando o bOVA penetrar a membrana como um criador. Neste do microsome purificado, alguns adicionados exogenamente bOVA ainda foi preservado em frações de membrana, mas foram transportado para a parte externa do microsome e então ubiquitinated e processada em vitro29. Este microsome purificado contidos não só endocítica compartimento específico proteínas, mas também proteínas ER-residente para ERAD e o peptídeo carregamento complexo; sugerindo que o compartimento celular é o compartimento endocítica prospectivo para CP29. Este protocolo não é dependente do tipo de antígenos exógenos e também é aplicável para outros subconjuntos de DC e outros tipos de células, como macrófagos, células B e células endoteliais, para esclarecer o mecanismo molecular preciso de DCs para CP proficiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em estudos anteriores de CP, os antígenos exógenos incorporados acumularam na área restrita do atrasado endosome ou ER por microscopia de imunofluorescência16,30,31,32. Estima-se que ERAD, como transporte e processamento de antígenos exógenos são realizados nestas áreas especializadas da ER ou endossomo atrasado, como o compartimento celular foi identificado pela sacarose ou iodixanol u…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela Universidade de Takasaki da saúde e bem-estar.
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
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