JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingeniería

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/55982
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine,Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences,Tsinghua University

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של microcryogels אלסטית macroporous תלת-ממד על-ידי שילוב מיקרו-מלאכותית עם טכנולוגיית cryogelation. בעת טעינת עם תאים, נוצרים 3D microtissues, אשר יכול להיות מוזרק בקלות בתוך vivo כדי להקל על הטיפול משובי או לצרפן מערכים להקרנה תפוקה גבוהה סמים ‘ במבחנה .

Abstract

לשדרג תרבית תאים דו-ממדית מסורתית תרבית תאים תלת-ממד, לנו יש משולב מיקרו-מלאכותית עם cryogelation טכנולוגיה כדי לייצר cryogels microscale macroporous (microcryogels), אשר ניתן לטעון עם מגוון רחב של סוגי תאים כדי ליצור microtissues תלת-ממד. במסמך זה, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לפברק microtissues תלת-ממד תכליתי ושימושיהם לטיפול רגנרטיבית ו והתרופות הקרנה. הגודל של צורה-הקמת microcryogels יכול להיות מפוברק על שבב מערך, אשר יכול להיות שנקטפו את שבב כמו ספקים יחידים שנטענו תא לטיפול משובי להזרקה או להיות בהמשך שהורכבו על שבב לתוך מערכי microtissue תלת-ממד עבור תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה. בשל אופיו אלסטי גבוהה של אלה cryogels microscale, microtissues 3D התערוכה injectability נהדר לטיפול פולשנית תא על-ידי הגנה על תאים מכוח מכני הטיה במהלך ההזרקה. פעולה זו מבטיחה הישרדות cell משופרת, האפקט הטיפולי במודל איסכמיה איבר העכבר. בינתיים, הרכבה של מערכים 3D microtissue בתבנית תקנית 384-multi-ובכן מקלה את השימוש נפוץ למתקני המעבדה וציוד, הפיכת סמים תפוקה גבוהה הקרנת בפלטפורמה זו תרבות תא תלת-ממד תכליתי.

Introduction

תרבית תאים מסורתי על משטחים (2D) דו מימדי שעברו שיטוח, כגון לצלחת תרבות או צלחות רב טוב, בקושי יכול להפיק תא התנהגויות קרוב מדינות מקורי שלהם. החוק הביוגנטי מדויק של יליד microenvironments הסלולר, המהווים תא מסוגים שונים, מטריצה חוץ-תאית וכן גורמים מסיסים ביואקטיביות ארכיטקטורות תלת מימדי (3D)1,2,3 ,4, חיוני לבניית biomimicking רקמות במבחנה עבור יישומים ב רפואה הנדסי, רגנרטיבית רקמות, ביולוגיה היסוד למחקר, סמים גילוי5,6,7 8, ,9.

במקום תרבית תאים 2D, תרבית תאים 3D נעשה שימוש נרחב כדי לקדם את המיקרו-ארכיטקטוני ביונים ותרבותית פונקציונלי תכונות של תאים במבחנה. שיטה תרבות פופולרית תא 3D הוא התאים צבירה spheroids7,8,9,10. Spheroids הסלולר יכול להיות מוזרק לרקמות פצוע עם שימור הסלולר משופרת של הישרדות לעומת הזרקה של התאים התפזרו. עם זאת, לא אחידה ספרואיד וגדלים נמנע פגיעה מכנית המוטלות על תאים בכוח גזירה נוזלים במהלך ההזרקה להוביל תא המסכן השפעות טיפוליות11,12,13. באופן דומה, הלא-ריינולדס במהלך צבירה של spheroids הפך שלהם תרגום 3D מבוססת תא תפוקה גבוהה סמים הקרנת מאתגר10.

שיטה נוספת עבור תרבית תאים תלת-ממד מושגת בסיוע biomaterials, המכנסת בדרך כלל התאים hydrogels מימית או פיגומים נקבובי. היא מאפשרת וגמישויות גדול לבניית ארכיטקטורות תלת-ממד. לטיפול, תאים במארז בצובר פיגומים מועברות בדרך כלל הגוף החי באמצעות השרשה כירורגי, אשר פולשנית וטראומטית, ומכאן הגבלת שלה תרגום רחב אל מיטתה. מצד שני, hydrogels מימית מאפשרים טיפול פולשנית באמצעות הזרקת תאים מושעה בפתרון קודמן הידרוג לתוך גופים בעלי חיים, ומאפשר בחיי עיר gelation ויה תרמו-כימיים או אנזימטי crosslinking11. אולם, כמו תאים מועברים בזמן סימנים מקדימים הידרוג נמצאים עדיין במצב מימית, הם גם חשופים מכניים הטיה במהלך ההזרקה. לא רק אז, crosslinking כימי או אנזימטי במהלך בחיי עיר gelation של הידרוג גם עלול לגרום נזק לתאי בתוך. להקרנה סמים, תרביות תאים בסיוע biomaterial מול בעיות עם אחידות, בקירות וצפיות והתפוקה. שימוש hydrogels, תאים בדרך כלל מעורבים במהלך gelation, שבו התהליך עשוי להשפיע על הכדאיות תא ותפקוד. Gelation במהלך תא זריעה גם מקשה שימוש על ידי רוב הציוד תפוקה גבוהה, כיוון הידרוג ייתכן שיהיה עליך לשמור על הקרח כדי למנוע gelation לפני תא זריעה, הידרוג עלול לשבש שחולק עצות, אשר הם בדרך כלל מאוד רזה כדי להבטיח דיוק עבור הקרנת תפוקה גבוהה. פיגומים הקבועים מראש יכול באופן פוטנציאלי להפריד הליכי ייצור biomaterial תרבית תאים, עם זאת רוב מוצרים מבוססי לגרדום זמינים כמו חומרי תפזורת עם תפוקה נמוכה יותר יחסית14.

כדי להתגבר על חלק החסרונות של שיטות התרבות תלת-ממד, פיתחנו טכנולוגיה מיקרו-מלאכותית-cryogelation משולב להמציא שבב של מערך מדף וידידותית microcryogel15. פרוטוקול זה, ג’לטין מסומנת לצורך המחשה טכניקת ייצור microcryogel כפי זה מסתיימים, מתכלה, חסכונית, ללא כל שינוי נוסף נדרש עבור התא מצורף. פולימרים אחרים של מקורות טבעיים או סינתטיים יכול לשמש גם עבור פבריקציה נוספת, בהתאם ליישום. באמצעות טכנולוגיה זו, אנו יכולים לפברק microcryogels קימור קטן וגמיש מאוד לשליטה בגודל, צורה, פריסה. בעת טעינת עם מגוון רחב של סוגי תאים, 3D microtissues יכול להיווצר ליישומים שונים. תכונות ייחודיות אלה מאפשרות injectability הרצויה, הגנה על תאים ושמירה האתר מכוון לאחר הזרקת ויוו לאפקטים טיפולית משופרת. לא רק אז, microcryogels יכולה להיות מעובד יותר כדי ליצור מערכים 3D microtissue התואמים נפוצות מעבדתי וציוד כלים להבין תרבית תאים תפוקה גבוהה רב-תכליתי והתרופות הקרנה, מבחני סלולר אחרות. במסמך זה, שיפורט תהליך ייצור של microcryogels והטיפול שלאחר כמו microtissues 3D בודדים או מערכים microtissue תלת-ממד עבור שני יישומים חשובים, טיפול בתאי והתרופות הקרנה, בהתאמה10,15 .

Protocol

ניסויים בבעלי חיים עקב פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה חיה על מרכז של אנליזה ביו-רפואית, באוניברסיטת צינג. תחת אישור של ועדת האתיקה, רקמת שומן אנושי ממנו הושג המחלקה של ניתוחים פלסטיים של פקין האיחוד חולים עם הסכמה מדעת של החולים- 1-ייצור של תלת-ממד Microcryogels עיצוב, …

Representative Results

ייצור ואפיון של microcryogels עבור microtissue תלת-ממד מערך. על פי פרוטוקול זה, microcryogels זוייפו. טופס 3D microtissues ו microcryogels בודדים או מערכים microcryogel, הוחלו על טיפול משובי וסמים הקרנה, בהתאמה (איור 1). Microstencil שבבים מפוברק מן PMMA הוחלו כ?…

Discussion

הרגנרציה לרפואה במבחנה דגמים להקרנה סמים הם שני יישומים חשובים בשביל לרקמות הנדסה5,6,7,8,9. בעוד שני יישומים לצרכים שונה לחלוטין, מכנה משותף ביניהם טמון בצורך ביונים יותר culturing תנאי כדי לשפר את התא ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מבחינה כלכלית נתמך על ידי קרן מדעי הטבע הלאומי של סין (מענקים: 81522022, 51461165302). המחברים רוצה להודות לכל חברי המעבדה Du לסיוע כללי.

Materials

Gelatin sigma G7041 All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde  J&K 902042 Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm) CITOGLASS, China 10212450C To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4 Beijing Chemical Works 116-8 To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar asperts, China VC8130 To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets  Sunjin Electronics Co., Ltd, China Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system Rayjet, Australia Rayjet 50 C30 To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner Mycro Technologies, USA PDC-32G To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer Boyikang, China SC21CL To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%) Zhongkekeao, China DA0065 To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride ENERGY CHEMICAL, China A01E0801360010 To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) CS01-10 To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue Promega (Wisconsin, USA). G8080 To test cell viability.
Cell strainer BD Biosciences, USA 352360 To collect microgels.
D-Luciferin SYNCHEM (Germany) s039 To tack cells.
Scanning electron microscope FEI, USA Quanta 200 To characterize microgel morphology.
 Mechanical testing machine Bose, USA 3230 To measure mechanical features.
Programmable syringe pump  World Precision Instruments, USA ALADINI 1000 To test injactabiliy.
Digital force gauge HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China H-50  To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC AN74i To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader Molecular Devices,USA M5 To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope Nikon, Japan A1Rsi To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system Caliper Life Sciences, USA IVIS To track cell in animals.
Liquid work stataion Apricot design,USA S-pipette To load medium or cell suspension high-throuputly.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179 (2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141 (2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581 (2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056 (2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

Tags

Regenerative TherapyDrug ScreeningCryogelationGelatinMicrocryogelsPMMA MicrostencilPDMS Ejector PinLyophilizationHigh-throughput

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Li, Y., Yan, X., Liu, W., Zhou, L., You, Z., Du, Y. 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening. J. Vis. Exp. (128), e55982, doi:10.3791/55982 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image