저항 동맥의 세포 문화 모델
Summary
저항 동맥의 세포 문화 모델, 신호 경로 내 피, 평활 근, 또는 피와 부드러운 근육 (myoendothelial 교차점) 사이 해 부에 대 한 수 있도록 설명 되어 있습니다. 이 셀 문화 모델을 사용 하 여 면역 형광 검사, 전자 현미경, 또는 단백질 격리, 촉진제의 선택적 응용 프로그램을 활용할 수 있습니다.
Abstract
Myoendothelial 접합 (MEJ), 작은 직경 저항 동맥에 독특한 신호 microdomain 특정 단백질과 혈관 음색 및 혈압을 제어할 수 있는 신호 프로세스의 지역화를 전시 한다. 그것에서 프로젝션 내 피 또는 부드러운 근육 세포와 그것의 작은 때문에 MEJ (평균에, ~ 1 µ m2의 영역), 크기 격리에서 공부 하기 어렵습니다. 그러나, 우리는 MEJ 대형 생체 외에서 내 피 세포의 양극 화, 그리고 신호 단백질 및 프로세스의 저항 혈관 벽에의 해 부에 대 한 있도록 혈관 세포 공동 문화 (VCCC) 라는 세포 문화 모델 개발 동맥입니다. VCCC 다양 한 응용 프로그램 있으며 서로 다른 세포 유형에 맞게 적용할 수 있습니다. 0.4 µ m 모 공에는 생체 외에서 MEJs를 형성할 수 있습니다와 필터의 반대 측에 2 개의 세포 유형 모델에 의하여 이루어져 있다. 여기 우리가 설명 셀의 도금 및 절연의 내 피, 통해 VCCC 만드는 방법을 MEJ, 및 단백질 격리 또는 활동에 사용할 수 있습니다 부드러운 근육 분수 분석 실험. 포함 된, 그리고 immunofluorescent 분석 sectioned에 그대로 셀 레이어 필터를 해결할 수 있습니다. 중요 한 것은,이 모델에서 발견의 많은 생리 적인 관련성을 강조 하는 그대로 저항 동맥을 사용 하 여 확인 되었습니다.
Introduction
작은 직경 저항 동맥, 얇은 내부 탄력 있는 lamina (IEL) 내 피 (EC)와 평활 근 세포 (SMC)를 분리합니다. 셀이 탄성 매트릭스에 구멍을 통해 프로젝트 하 고 갭 정션 채널1,2를 통해 직접 세포질 연결을 만들 수 있습니다. 이 독특한 구조는 myoendothelial 접합 (MEJ) 이라고 불린다. MEJ 작은 (약 0.5 µ m 혈관 침대에 따라 0.5 µ m x), 셀룰러 투영 하지만 내 피 세포의 주로 구성3,4뿐만 아니라 부드러운 근육에서 발생 한 수 있습니다. 수 사관의 수 신호 그것은 피와 부드러운 근육5 사이의 양방향 신호 촉진을 위한 특히 중요 한 위치를 렌더링 MEJ에 선택적으로 발생 하는 네트워크의 엄청난 복잡성을 증명 하고있다 ,6,,78,,910.
그러나,는 MEJ에 신호 통로의 기계 해 부 그대로 동맥에서 어렵습니다. MEJ 셀룰러 프로젝션 때문에 그것 불가능 현재는 비보에 MEJ 혈관 벽에서 분리 합니다. 이러한 이유로 VCCC 모델1 개발 되었다. VCCC 생리 내 피 형태11 와 양극 화는 꼭대기 사이 신호를 복제 하는 중요 한 것은, 셀12MEJ 부분. 그것을 발견 알파 헤모글로빈에에서 있는 내 피 세포는 MEJ에 편광이 독특한 모델 이었습니다. 이것은 알파 헤모글로빈13를 표현 하지 않는 전통적으로 교양된 내 피 세포와 달리 이다. Microvascular 내 피에 관심이 연구원에 대 한 더 작은 직경 저항 동맥에서 발생 하는 신호 경로 해 부 하는 것입니다 의도 하는 경우에 특히 VCCC에서 경작 된 내 피 세포를 사용 하 여 적절 한 수 있습니다.
공동 문화 2 가지 종류를 튼튼한 플라스틱 삽입을 포함 하는 직경이 작은 숨 구멍 (직경에서 0.4 µ m)와 필터를 사용 하 여 계층 간의 마이그레이션에서 세포를 방지 합니다. 그것은 크게 비보, 보다 긴 하지만 여전히 많은 MEJs, 단백질 지 방화, 두 번째 메신저1 신호 등의 비보에 특성의 복제 세포 사이의 10 µ m 거리에서 결과 , 14. 또한는 VCCC 셀 주 작동 근 또는 특정 세포 구획에 적의 추가 통해 신호 유형 특정의 대상에 대 한 수. 예를 들어 BAPTA-킬레이트 칼슘, 오전으로 EC를 로드 하 고 phenylephrine14SMC를 자극. 이 제공 하는 공동 문화 모델15,,1617,18,19,20,21의 다른 설명, 달리 지침에 mRNA와 단백질, 필터 모 공 내의 별개 MEJ 분수를 포함 하 여 독특한 분수를 분리. VCCC에이 기술 추가 mRNA 현지화 또는 전사22,23, 단백질의 인 산화12,및 단백질 활동12변화의 특정 조사 수 있습니다. 이 기사 다른 conformations11,,1824두 세포 유형 문화 수도 있지만 아래에 필터와 SMC EC의 도금 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
VCCC는 다양 한 MEJs에서 생체 외에서업과 측면에서 이점 하지만 토론의 경우는 VCCC 특정 응용 프로그램에 대 한 이용 될 수 있다 결정할 때. 예를 들어 다른 세포 유형이이 모델 사용할 수 있다면, 그것은 최적화가 필요 합니다. 우리는 기본 인간 세포 사용 하지만 소 aortas24또는 wildtype 또는 녹아웃 쥐에서 세포를 분리 하 여 사용 VCCC1,5<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국가 심 혼에 의해 지원 되었다, 폐 및 혈액 학회 R01088554, T32HL007284 및 미국 심 혼 협회 predoctoral 친목 14PRE20420024 부여 합니다. 우리는 특히 세인트 주드 세포 이미징 공유 연구 핵심, 랜달 웨이크필드와 전자 현미경 이미지에 대 한 린다 Horner, 아담 스트로브를 통해 대표적인 면역 형광 이미지, 및 그녀에 대 한 Pooneh Bagher를 포함 하 여 감사 합니다. 원고 프로토콜에 귀중 한 피드백입니다.
Materials
| 24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225cm2 flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
Referencias
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