Perla base ensayo Multiplex para el análisis de perfiles de Cytokine de lágrima

Summary

Análisis de la película del rasgón citoquinas ayuda en el estudio de varias enfermedades oculares. Ensayos multiplexores grano base son sencillas y sensibles y permiten el análisis de múltiples objetivos en muestras con pequeños volúmenes. Aquí se describe un protocolo para rasgar película del cytokine perfilar un uso grano base ensayo múltiple.

Abstract

Película lagrimal es una mezcla compleja de lípidos, proteínas y minerales que cubre la superficie externa del ojo, proporcionando así lubricación, nutrición y protección a las células subyacentes. Análisis de las lágrimas es un área emergente para la identificación de biomarcadores para la predicción, diagnóstico y pronóstico de diversas enfermedades oculares. Lágrimas son fácilmente accesibles y su colección es no invasivo. Por lo tanto, avance de la tecnologías están ganando protagonismo para la identificación de múltiples analitos en lágrimas para estudiar cambios en la composición de la proteína o metabolito y su asociación con condiciones patológicas. Citoquinas de lágrima son biomarcadores ideal para el estudio de la salud de la superficie ocular y también ayudan en la comprensión de los mecanismos de diferentes desordenes superficiales oculares como enfermedad del ojo seco y conjuntivitis vernal. Ensayos multiplexores grano base tienen la capacidad de detectar múltiples analitos en una pequeña cantidad de muestra con una mayor sensibilidad. Aquí describimos un protocolo estandarizado de recolección de muestras de lágrima, extracción y análisis de citoquinas perfiles utilizando una tira basan ensayo multiplex.

Introduction

Lágrimas son producidas por la glándula lagrimal y glándulas accesorias y cubrir la superficie externa del ojo. Película lagrimal consta de una capa de lípidos externa y una capa acuosa interna que incluye proteínas solubles, mucinas y membrana limitada mucinas. Lágrimas prevenir invasión microbiana, suministrar nutrientes y proporcionan lubricación a la superficie ocular. Lágrimas actúan como una interfaz entre el aire y el tejido para el transporte de oxígeno a la córnea. ¹ la película lagrimal se compone de proteínas, carbohidratos, lípidos y electrólitos. La asociación entre las proteínas de la lágrima con enfermedades oculares y sistémicas como enfermedad del ojo seco, conjuntivitis vernal, glaucoma, diabetes mellitus, cáncer y orbitopatía tiroidea asociada ha sido identificado en varios estudios. ^{2 , 3 , 4} muestras de lágrima se pueden recoger por los tubos de microcapillary o de flujo lagrimal (Schirmer tiras). Además, prueba de Schirmer es un procedimiento estándar realizado en la córnea y cirugía refractiva clínicas, cuyos resultados pueden utilizarse para los ensayos de análisis del cytokine. Toma de muestra no invasiva, accesibilidad de la muestra de bio y la Asociación de la composición de la lágrima con varias condiciones fisiológicas y patológicas que una potencial fuente de biomarcadores para varias enfermedades oculares y sistémicas de la película del rasgón. ^{4 , 5 , 6}

Rasgón de citoquinas juega un papel importante en el estudio de la salud ocular superficial y las condiciones inflamatorias de diferentes enfermedades oculares. ⁷ concentraciones anormales de varias citoquinas en las muestras de lágrima se informaron a estar asociada con la enfermedad del ojo seco, queratoconjuntivitis vernal (VKC), queratoconjuntivitis atópica (AKC), conjuntivitis alérgica estacional y uveitis. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} las proteínas de la lágrima pueden analizarse por métodos tradicionales como la espectrometría de masas, western blot y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). ^{14 , 15} sin embargo, las limitaciones de estos métodos son sensibilidad pobre y un mayor volumen de muestra requerido para el análisis de múltiples citoquinas, desgarro en cada paciente. ^{16 , 17} ensayos multiplexores grano base se han desarrollado para analizar múltiples analitos en muestras de la mezcla compleja y aplicado con éxito en muestras de lágrima para analizar múltiples citoquinas en diferentes enfermedades. ^{6 , 18} A combinación de sandwich ELISA y técnicas de citometría de flujo permiten estos ensayos a ser más sensible que el ELISA para la cuantificación de múltiples analitos en una sola muestra. ¹⁹ este método puede ser aplicado en una variedad de muestras clínicas y sobrenadantes de cultivo celular y ayuda en el estudio de las respuestas inmunes en varias condiciones fisiopatológicas. ^{20 , 21 , 22 , 23 , 24}

Existen varios estudios comparando múltiplex de grano basado en ensayos de ELISA y han reportado una correlación entre los métodos. Loo et al. en comparación con grano base ensayo multiplex con ELISA convencional para la detección de la adiponectina, resistina, leptina y grelina en muestras de suero o plasma humano y reportado una fuerte correlación (r > 0.9) entre los ensayos. ²⁵ Dupont et al reportó una fuerte correlación entre ensayos multiplex grano base y ELISA para la detección de IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ y TNF-α en la fitohemaglutinina y lipopolisacárido estimularon sangre entera recogidos de las mujeres embarazadas. ²⁶ Pickering et al reportó otro fuerte correlación entre el ensayo múltiple de grano base y ELISA para la detección de anticuerpos del suero a polisacárido de Haemophilus influenzae tipo b (r = 0.96), Toxoides de Tetani del Clostridium (r = 0.96) y Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91). ²⁷ Biagini et al informaron una alta correlación positiva (r = 0.852) entre grano basado en análisis multiplex y ELISA para la detección de Bacillus anthracis anti-PA IgG en muestras de suero. ²⁸ Wang et al informaron una correlación entre el ensayo múltiple de grano base y ELISA para la detección de biomarcadores de la enfermedad de Alzheimer amiloide-β 42 (r = 0.77), tau total (r = 0,94) y tau fosforilada en aminoácido 181 (r = 0,82) en muestras de líquido cefalorraquídeo. ²⁹ estos estudios han demostrado que la aplicabilidad de grano en variedad de muestras clínicas, requisitos de volumen de muestra más pequeños y una correlación con ELISA estándar, que hacen ensayos multiplex grano basado en un prometedor base ensayos multiplexores alternativa a los tradicionales métodos de ELISA para la detección de múltiples analitos en diferentes tipos de muestras en fenotipos diferentes de la enfermedad. Aquí describimos un protocolo estandarizado para el ensayo múltiple de grano base de perfiles de citocinas para 41 analitos en muestras de lágrima recolectadas de sujetos sanos utilizando tiras de Schirmer.

Protocol

los protocolos utilizados en este estudio fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de Tan Tock Seng Hospital, Singapur. 1. análisis del Cytokine del rasgón colección de lágrimas: pedir el tema para sentarse cómodamente en una silla de examen y coloque su cabeza contra la cabecera. Pedir el tema para ver, cuidadosamente abrir las tiras de Schirmer (hechas de papel de filtro Whatman no. 41) y coloque el extremo redondeado de la…

Representative Results

Se recolectaron muestras de desgarro de 8 ojos de 4 sujetos sanos utilizando tiras de flujo lagrimal y niveles del cytokine fueron analizados utilizando el protocolo mencionado. Todos los sujetos eran varones y la edad de los cuatro temas fue de 36, 42, 44 y 52 años respectivamente. Salud de superficie ocular y ojo seco la enfermedad fue evaluada por ensayos clínicos (rotura de película lagrimal tiempo, Schirmer prueba, tinción corneal, tinción conjuntival, examen de la glándula mei…

Discussion

Las citoquinas son pequeñas proteínas de secreción celulares y potentes moduladores inmunes, regula las respuestas inmunitarias. ³² los perfiles de expresión de varias citoquinas en el desgarro las muestras están relacionadas con diversas condiciones patológicas del ojo y estudios sobre citocinas perfiles ayudan a comprender los mecanismos de patogénesis de la enfermedad, determinar el estado de salud ocular, severidad de la enfermedad, diagnóstico y evolución. ² <…

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit	Merck, USA	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument	Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software	Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software	BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1	BIO-RAD, France
Plate shaker	Corning, USA
TECAN Microplate Washer	Tecan, Switzerland	HydroSpeed
Vortex Genie 2	Scientific Industries inc, USA	G560E
Pipettes	Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube	Axygen, USA	MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip	Eye Care and Cure, USA	101657
Flexmap 3D Calibration Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-028
Flexmap 3D Verfication Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-029
Ocular examination chair