Количественные локализация белка Гольджи изображения его масса центр флуоресценции
Summary
Точная локализация Гольджи жителей имеет важное значение для понимания клеточных функций Гольджи. Однако не удалось разрешить суб Гольджи структуры обычных оптической микроскопии. Здесь мы описываем протокол для обычных микроскопии основанные метода суперразрешением количественно определить суб Гольджи локализация белка.
Abstract
Комплекс Гольджи состоит из межклеточная серийно сложены мембраны, которые могут быть далее разделены на суб Гольджи регионы, включая СНГ-Гольджи, медиальной Гольджи, транс-Гольджи и транс-Гольджи сети. Клеточных функций Гольджи определяется характерное распределение его резидентов белков. Пространственное разрешение обычных световой микроскопии слишком мала, чтобы разрешить суб Гольджи структуры или межклеточная. Таким образом электронная микроскопия иммуно золото является методом выбора для локализации белков на уровне суб Гольджи. Однако техника и инструмент выходят за рамки возможностей большинства лаборатории биологии клетки. Здесь мы описываем наш недавно разработанных суперразрешением метод, вызываемый Гольджи белка локализации изображений центры масс (GLIM) систематически и количественно локализовать Гольджи белка. GLIM основана на стандартных флуоресценции маркировки протоколы и обычных-поля или конфокальные микроскопы. Она включает в себя калибровка хроматической сдвига аберрации микроскопические системы, загрузки изображений и анализа после приобретения. Суб Гольджи локализация белка тест количественно выражается как фактор локализации. Существует четыре основных преимущества GLIM; Это быстрый, основанные на традиционных методов и инструментов, в результате локализацией количественных, и он дает ~ 30 Нм практические резолюции вдоль оси Гольджи. Здесь мы описываем подробный протокол GLIM для локализации тест Гольджи белка.
Introduction
Комплекс Гольджи играет существенную роль в секреторную/endocytic людьми из белков и липидов (далее грузов) в mammalian клетках1,2,3. В Гольджи грузов являются не только отсортированы по различным субклеточном отсеков, но также изменены различные виды гликозилирования. Млекопитающих Гольджи комплекс включает в себя многочисленные боково связанные стеки Гольджи, который обычно состоит из 4-11 плотно прилегающие и плоские мембраны мешков называемые межклеточная. Серийно сложены межклеточная Гольджи далее подразделяются, от одного конца до другого, как СНГ, медиальной и транс-межклеточная. На транс-боковые стека Гольджи, транс-большинство мембраны мешок превращается в трубчатых и ретикулум мембраны сеть под названием транс-Гольджи сети (TGN)4. В секреторную путь, грузов, полученных от эндоплазменный ретикулум (ER) введите Гольджи стека в СНГ-стороне и затем последовательно проходят через медиальной и транс-межклеточная. Грузов в конечном итоге выход Golgi в транс-Гольджи или TGN предназначения в плазматической мембране, endosomes или секреторных гранул.
Молекулярных и клеточных механизмов как грузов транзита Гольджи стека и как Гольджи сохраняет свою cisternal Организации остаются загадочными и в настоящее время все еще горячие дебаты1. Одна из трудностей в этой области является, что Гольджи межклеточная могут быть решены только при электронной микроскопии (EM) со времени принятия резолюции оптический микроскоп (~ 200 Нм) является недостаточным для решения индивидуальных Гольджи межклеточная (< 100 Нм в обоих cisternal толщины и расстояние). Таким образом суб Гольджи локализации-резидентов белков и транзитных грузов, условно определяются EM иммуно золото. Однако EM иммуно золото очень технически сложных и это выходит за рамки возможностей большинства лаборатории биологии клетки. Хотя резолюции EM может быть югу нанометров, резолюции, обеспечиваемой EM иммуно золото значительно затрудняется размер антител комплекса (основной плюс вторичное антитело) и золотые частицы, и он может быть хуже, чем 20 Нм. Кроме того EM изображения получаются из 2D тонких секций вместо 3D глобальное представление Гольджи, который может привести к ошибочным выводам в зависимости от относительной позиции и ориентации 2D раздела5. Например изучая EM односекционный способна надежно дифференцировать везикул от ортогональных мнению трубочку, так как оба может отображать одинаковых круглых мембраны профили. Недавнее появление суперразрешением микроскопии методы, такие как 3D-структурированных освещения микроскопии (3D-SIM), стимулировали выбросов истощения (интереса), photoactivated локализации микроскопии (PALM) и стохастические оптических реконструкции микроскопии ( Шторм), делает возможным решить суб Гольджи структуры под легкие Микроскопы6. Однако есть по крайней мере четыре недостатки, которые могут значительно ограничить их использование в изучении биологических клеток Гольджи. 1) текущего суперразрешением методы требуют дорогих и специальные аппаратной конфигурации, которая выходит за рамки большинства лаборатории биологии клетки. 2) специальные флуоресценции маркировки протоколы необходимы для некоторых методов суперразрешением. 3) хотя, в лучших условиях, эти методы утверждают 20-110 Нм в пространственным разрешением, практические резолюции, полученные в реальных образцов может быть гораздо хуже. 4) в сравнении с обычными микроскопии эти супер-резолюции методы по-прежнему испытывают трудности в проведении многоцветная, 3D или жить клеток изображений, поодиночке или в сочетании. Наверное самое главное, иммуно золото EM и методы микроскопии суперразрешением выход качественных вместо количественных локализации данных.
Попытке частично решить проблемы, упомянутые выше, мы недавно разработали обычной световой микроскопии основанные метод, который называется Гольджи белка локализации изображения центры масс (GLIM), систематически и количественно локализовать Golgi белка с разрешением эквивалентна иммуно золото EM7. В этом методе Гольджи культивируемых клеток млекопитающих рассеивается как Гольджи мини стеки, лечение Нокодазол, микротрубочки depolymerizing наркотиков. Обширные исследования показали, что Нокодазол индуцированной Гольджи мини стеки (далее мини стеки Гольджи) напоминают родной Гольджи стеки в Организации и клеточных функций8,9,10, 11. Локализации (LQ) частное от деления теста белка могут быть приобретены через GLIM и он обозначает количественные суб Гольджи локализации. Численные значения LQs можно сравнить и LQ базы данных более чем 25 Гольджи маркеров была доступна.
В GLIM Гольджи мини стеки, тройной меченых эндогенного или экзогенно выраженной GM130, Галт mCherry и тест белка (x). GM130 и Галт mCherry, СНГ– и транс-Гольджи маркеры соответственно12,13, предоставления ориентиры. Тройной флуоресценции, красный (R), зеленый (G) и far-red (B), искусственно отображаются как красный, зеленый и синий, соответственно. Центр флуоресценции массы (далее центр) принимается для достижения субпиксельной резолюции. Гольджи оси определяется как вектор от центра GM130, Галт mCherry. Мини-стек Гольджи моделируется как цилиндрические структуры с бесконечной вращательная симметрия вокруг оси Гольджи. Таким образом Гольджи мини-стек может моделироваться далее как одномерные структуры вдоль оси Гольджи. Альбумин белка тест x определяется как dx/d1, в котором dx — это расстояние от центра x, GM130, в то время как d1 представляет собой расстояние от центра Галт mCherry, GM130. Если центр x-оси, его осевое расстояние проекции используется для вычисления. Переменные, включая Гольджи оси, осевой угол, dx, д1, угол α и β угол, для GLIM схематически показан на рисунке 1. LQ независима от Golgi осевой угол хотя Гольджи мини стеки Ориент случайно в клетке.
Гольджи мини-стеки неоднородных в изображениях. Мы разработали три критерия для выбора анализируемые Гольджи мини стеки для GLIM. 1) отношение сигнал шум критерий, в котором отношение общей интенсивности Гольджи мини-стек стандартное отклонение (SD) фона составляет ≥ 30 в каждом канале. Этот критерий является обеспечить точность позиционирования центра масс, которая зависит от соотношения сигнал шум Гольджи мини-стеков. 2 осевой угол или расстояние критерий, который требует d1≥ 70 нм. d1 уменьшается с увеличением угла осевой Гольджи. При осевом угол приближается к 90° или вертикальные, Мини-стек становится неразрешимым как d1 приближается к 0. d1≥ 70 нм можно эффективно исключить вблизи вертикальных Гольджи мини стеки. 3) в которых либо co линейность критерий | загар α | или | загар β | Это ≤ 0,3. Этот критерий гарантирует, что трех центров мини-стек достаточно co линейная для нашего одномерной модели мини-стек Гольджи. Все легкие Микроскопы страдают от хроматические аберрации, которые могут серьезно исказить относительные позиции флуоресценции красного, зеленого и far-red центров. Хроматическая аберрация Микроскоп систем экспериментально Калибровка изображения 110 Нм бусы, которые обозначены тройной флуоресценции красного, зеленого и far-red. Для каждого изображения из бисера центр Красного определяется как истинное положение шарик и хроматические смены зеленого и far-red центры оснащены первого порядка полиномиальных функций. Центры Гольджи мини стеки подвергаются полиномиальных функций исправить хроматические сдвиги в зеленых и far-red каналы.
Через GLIM мы можем достичь урегулирования ~ 30 Нм вдоль оси Golgi в стандартных условиях. Важно то, что он предоставляет системный метод количественно сопоставить любой белок Гольджи. GLIM могут выполняться с обычными Микроскопы, например поля или конфокальные микроскопы, используя общие протоколы Маркировка флуоресцирования. Визуализация и обработка данных может занять как час короче. Через GLIM, мы непосредственно продемонстрировали прогрессивного перехода секреторной грузов из стран СНГ– транс-стороне Гольджи7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ранее локализация белка Гольджи под световой микроскопии главным образом была количественно оценена степень корреляции или дублирование изображения белка с изображением Гольджи маркер известных локализации15,16, 17. Результате коррел…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить D. Стивенс (Бристольский университет, Бристоль, Соединенное Королевство) за TPST1-EGFP ДНК плазмиды, а также Лакшми Нарасимхан ГОВИНДАРАДЖАН за помощь в оптимизации программного обеспечения. Эта работа была поддержана субсидии от национального совета медицинских исследований (NMRC/CBRG/007/2012), министерства образования (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 и RG132/15 и AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) л.л.
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
Referencias
- Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
- Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
- Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
- Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
- Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
- Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
- Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
- Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
- Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).
- Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
- Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).
- Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
- Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
- Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
- Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
- Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
- Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
- Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).
