Localização de quantitativa de uma proteína de Golgi por imagem sua massa centro de fluorescência
Summary
A localização exacta dos residentes de Golgi é essencial para a compreensão de Golgi a funções celulares. No entanto, a microscopia óptica convencional é incapaz de resolver a estrutura sub-Golgi. Aqui descrevemos o protocolo para um método de super-resolução microscopia convencional baseado determinar quantitativamente a localização sub-Golgi de uma proteína.
Abstract
O complexo de Golgi consiste de pequenos membrana empilhados em série que podem ser classificados ainda mais em regiões sub-Golgi, incluindo o cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi e trans-rede de Golgi. Funções celulares do Golgi são determinadas pela distribuição característica de suas proteínas residentes. A resolução espacial de microscopia de luz convencional é demasiado baixa para resolver pequenos ou sub-Golgi estrutura. Assim, a microscopia eletrônica de imuno-ouro é um método de escolha para localizar uma proteína ao nível sub-Golgi. No entanto, o instrumento e a técnica estão além da capacidade da maioria dos laboratórios de biologia celular. Descrevemos aqui nosso método recentemente desenvolvido Super-resolução chamado a localização da proteína de Golgi por imagem centros de massa (GLIM) sistematicamente e quantitativamente localizar uma proteína de Golgi. GLIM baseia-se na rotulagem protocolos padrão de fluorescência e campo amplo convencional ou microscópios confocal. Envolve a calibração de aberração cromática-mudança do sistema microscópico, a aquisição de imagens e a análise de pós aquisição. A localização de sub-Golgi de uma proteína de teste é expressa quantitativamente como o quociente de localização. Existem quatro principais vantagens de GLIM; é rápida, com base em métodos convencionais e ferramentas, o resultado de localização é quantitativo e que proporciona ~ 30 resolução de nm prático ao longo do eixo de Golgi. Aqui descrevemos o protocolo detalhado de GLIM localizar um teste de proteína de Golgi.
Introduction
O complexo de Golgi desempenha funções essenciais no tráfico endocítica/secretoras de proteínas e lipídios (doravante cargas) em células de mamíferos1,2,3. No Golgi, cargas não são apenas classificadas para vários compartimentos celulares sub mas também modificadas por diversos tipos de glicosilação. O complexo de Golgi dos mamíferos compreende várias pilhas de Golgi lateralmente ligadas, que normalmente consiste de sacos de membrana firmemente adjacentes e plana de 4-11 chamados pequenos. Os pequenos de Golgi empilhados em série são mais categorizados, de um lado para o outro, como cis, medial e trans-pequenos. Para o trans-lado de uma pilha de Golgi, o trans-sac de membrana mais se desenvolve em uma rede de membrana tubular e retículo chamada trans-Golgi rede (TGN)4. Na via secretora, cargas derivadas do retículo endoplasmático (ER) Insira uma pilha de Golgi em seus cis-lado e em seguida sequencialmente passar medial e trans-pequenos. Cargas eventualmente sair do Golgi na trans-Golgi ou TGN destining à membrana plasmática, endossomos ou grânulos secretórios.
Os mecanismos moleculares e celulares de como cargas de trânsito uma pilha de Golgi e como o Golgi mantém sua organização cisternal permaneçam misteriosos e atualmente ainda estão sob um acalorado debate1. Uma das dificuldades neste campo é que pequenos de Golgi só podem ser resolvidos sob a microscopia de elétron (EM), desde a resolução do microscópio óptico (~ 200 nm) é insuficiente para resolver pequenos individuais de Golgi (< 100 nm em ambos espessura cisternal e a distância). Portanto, a localização de sub-Golgi das proteínas residentes e cargas em trânsito são convencionalmente determinado pelo EM imuno-ouro. No entanto, o EM imuno-ouro é tecnicamente muito exigente e está além da capacidade da maioria dos laboratórios de biologia celular. Embora a resolução da EM pode ser sub nanômetros, a resolução proporcionada pelo imuno-ouro EM grandemente é dificultada pelo tamanho do complexo anticorpo (primária mais anticorpo secundário) e a partícula de ouro e pode ser pior que 20 nm. Além disso, EM imagens são obtidas a partir 2D-cortes finos em vez de uma vista global 3D do Golgi, que pode resultar em conclusões errôneas dependendo da posição relativa e orientação do 2D seção5. Por exemplo, estudar uma única EM-seção é incapaz de confiantemente diferenciar uma vesícula do vista ortogonal de um túbulo desde que ambos podem exibir perfis idênticos membrana redondo. O recente advento de técnicas de microscopia de super-resolução, tais como a microscopia de iluminação 3D-estruturado (3D-SIM), estimulou a depleção de emissão (STED), microscopia de localização fotoativados (PALM) e reconstrução óptica estocástico microscopia ( TEMPESTADE), torna possível resolver estruturas sub-Golgi sob microscópios de luz6. No entanto, existem pelo menos quatro inconvenientes que podem limitar significativamente seus usos no estudo biológico celular do Golgi. 1) atual Super-resolução técnicas exigem a configuração de hardware caro e especial, que está além da maioria dos laboratórios de biologia celular. 2) protocolos de etiquetagem de fluorescência especiais são necessárias para algumas técnicas de super-resolução. 3) embora, nas melhores condições, estas técnicas afirmam 20-110 nm na resolução espacial, resolução prática obtida em amostras reais pode ser muito pior. 4) em comparação com a microscopia convencional, essas técnicas de super-resolução ainda tem dificuldades em realizar multicoloridas, 3D ou vivem a célula de imagem, isoladamente ou em combinação. Provavelmente o mais importante, tanto EM imuno-ouro e as técnicas de microscopia de super-resolução rendem qualitativo em vez de dados quantitativos de localização.
Tentar resolver parcialmente os problemas mencionados acima, recentemente desenvolvemos um método de microscopia de luz convencional com base, que é chamado a localização da proteína de Golgi por imagem centros de massa (GLIM), sistematicamente e quantitativamente localizar um Golgi proteína em uma resolução equivalente do imuno-ouro EM7. Neste método, o Golgi em células de mamíferos cultivadas é dispersado como minipilhas de Golgi pelo tratamento de nocodazole, uma droga depolymerizing de microtúbulos. Extensos estudos têm demonstrado que induzida por nocodazole Golgi minipilhas (doravante Golgi mini-stacks) assemelham a pilhas de Golgi nativas em organização e funções celulares8,9,10, 11. O quociente de localização (LQ) de uma proteína de teste pode ser adquirido através de GLIM e denota a localização sub-Golgi quantitativa. Os valores numéricos de QI pode ser comparados e um banco de dados do QI de mais de 25 marcadores de Golgi está disponível.
Em GLIM, minipilhas de Golgi são triplo-etiquetados por GM130 expressa forma exógena ou endógena, GalT-mCherry e a proteína de teste (x). GM130 e mCherry-GalT, cis– e trans-marcadores de Golgi12,13, fornecem, respectivamente, pontos de referência. A fluorescência tripla, vermelha (R), verde (G) e far-red (B), artificialmente são exibidos como vermelho, verde e azul, respectivamente. Centro de massa da fluorescência (doravante centro) é adotado para alcançar sub pixels de resolução. O eixo de Golgi é definido como o vetor do centro de GM130 ao de GalT-mCherry. Pilha mini de Golgi é modelada como uma estrutura cilíndrica com simetria de rotação infinita em torno do eixo de Golgi. Portanto, uma pilha mini de Golgi pode ser ainda mais modelada como uma estrutura unidimensional ao longo do eixo de Golgi. O QI da proteína teste x é definido como dx/d1, em que dx é a distância do centro da x ao de GM130, enquanto d1 é a distância do centro de GalT-mCherry ao de GM130. Se o centro do x está fora do eixo, sua distância de projeção axial é usada para o cálculo. As variáveis, incluindo Golgi eixo, ângulo axial, dx, d1, ângulo α e β ângulo, para GLIM são ilustradas esquematicamente na Figura 1. LQ é independente do ângulo axial Golgi embora minipilhas de Golgi orientam-se aleatoriamente em uma célula.
Minipilhas de Golgi aparecem não homogênea em imagens. Desenvolvemos três critérios para selecionar o minipilhas de Golgi analisáveis para GLIM. 1) o critério da relação sinal-ruído, em que a relação da intensidade total de uma pilha de Golgi mini para o desvio padrão (SD) do plano de fundo é ≥ 30 em cada canal. Este critério é garantir a exatidão de posicionamento do centro de massa, que varia de acordo com os rácios de sinal-ruído de minipilhas de Golgi. 2) o critério ângulo ou distância axial, que exige d1≥ 70 nm. d1 diminui com o aumento do ângulo axial de Golgi. Quando o ângulo axial se aproxima de 90° ou vertical, a mini pilha torna-se não puder ser resolvido como d1 aproxima-se 0. d1≥ 70 nm pode excluir efetivamente perto de minipilhas de Golgi verticais. 3) o critério de co-linearidade, em que | tan α | ou | tan β | é ≤ 0.3. Este critério garante que os três centros de um mini pilha são suficientemente co-linear para nosso modelo unidimensional de pilha mini de Golgi. Todos os microscópios de luz sofrem de aberração cromática que pode seriamente distorcem a posição relativa dos centros de fluorescência vermelha, verde e far-red. A aberração cromática de sistemas microscópio experimentalmente é calibrada por imagem 110 grânulos nm, que são triplo-etiquetados por fluorescência vermelha, verde e far-red. Para cada imagem do grânulo, o centro de vermelho é definido como a verdadeira posição do cordão de e cromático-turnos de verdes e far-red centros estão equipados por funções polinomiais de primeira ordem. Centros de minipilhas de Golgi estão sujeitos às funções polinomiais para corrigir os turnos-cromática nos canais verdes e far-red.
Através de GLIM nós pode alcançar uma resolução de ~ 30 nm ao longo do eixo de Golgi sob condições normais. Importante, ele fornece um método sistemático para quantitativamente, mapear qualquer proteína de Golgi. GLIM pode ser executada por microscópios convencionais, tais como campo amplo ou microscópios confocal, usando protocolos de etiquetagem de fluorescência comuns. A imagem e processamento de dados podem levar tão curtos quanto uma hora. Através de GLIM, diretamente demonstrámos a transição progressiva da carga secretora de cis– Trans-lado do Golgi7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anteriormente, a localização de uma proteína de Golgi sob a microscopia de luz principalmente foi quantificada pelo grau de correlação ou a sobreposição da imagem da proteína com a imagem de um marcador de Golgi de localização conhecida15,16, 17. A correlação resultante ou sobreposta coeficiente reflete o quão perto a proteína de teste é o marcador de Golgi espacialmente. Existem pelo menos três advertências pa…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a D. Stephens (Universidade de Bristol, Bristol, Reino Unido) para o plasmídeo de DNA TPST1-EGFP, bem como Lakshmi Nunes Govindarajan ajuda com a otimização de software. Este trabalho foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de pesquisa médica (NMRC/CBRG/007/2012), Ministério da educação (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 e 15/RG132 e AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) para L.L.
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
Referencias
- Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
- Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
- Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
- Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
- Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
- Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
- Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
- Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
- Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).
- Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
- Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).
- Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
- Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
- Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
- Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
- Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
- Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
- Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).
