Descrevemos um método baseado em HPLC para a determinação de ácido N-acetilneuraminico e ácido N-glicolilenuraminico em fígado e leite de rato.
A CMAH (hidroxilase de ácido citidina monofosfato-N-acetilneuramínico) é responsável pela oxidação de ácidos citidina monofosfato-N-acetilneuraminico em mamíferos. No entanto, os seres humanos não podem oxidar o ácido monofosfato-N-acetilneuramínico da citidina para o ácido monofosfato-N-glicolneuraminico de citidina devido a uma deleção primária de exão do gene CMAH . Para entender os efeitos e as implicações da falta de atividade do CMAH com mais detalhes, um modelo de nocaute Cmah em camundongos é de grande interesse na pesquisa básica e aplicada. O método de análise para determinar o fenótipo deste modelo de rato é aqui descrito em detalhe e é baseado na detecção de ácido N-acetilneuraminico e ácido N-glicolilenuraminico no fígado e leite de camundongos de tipo selvagem e Cmah knock-out. Os ácidos sialicos endógenos são liberados e derivados com o-fenilenodiamina para gerar derivados fluorogénicos, os quais podem ser posteriormente analisados por HPLC. O protocolo apresentado pode serTambém aplicou para a análise de amostras de leite e tecido de várias outras origens e pode ser útil para investigar os efeitos nutricionais e da saúde do ácido N-glicoliluramina.
O ácido N-acetilneuraminico (Neu5Ac) e o ácido N-glicolneuraminico (Neu5Gc) são os ácidos sialicos mais comuns na maioria dos mamíferos 1 . Embora capaz de sintetizar Neu5Ac de forma endógena, os seres humanos não são capazes de produzir Neu5Gc devido a uma deleção primária de exão no gene CMAH que codifica uma hidroxilase 2 , 3 de CMP-Neu5Ac. No entanto, os produtos alimentares baseados em animais podem ser fontes dietéticas de Neu5Gc 4 , 5 , 6 , levando à produção de anticorpos anti-Neu5Gc e, portanto, desencadeiam uma resposta imune em direção a Neu5Gc 7 . Este efeito dietético de Neu5Gc é suspeito de contribuir para a inflamação crônica e várias outras doenças 8 , 9 , 10 . A fim de compreender de forma abrangente os efeitos de Neu5Gc em hUm modelo animal para o estudo sistemático dos efeitos de ácidos sialicos de origem alimentar é altamente desejável. Embora os protocolos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) para a análise de camundongos nocaute estão bem estabelecidos e uma maneira conveniente para a avaliação genotípica, a análise funcional do fenótipo no nível metabólico requer métodos de análise mais específicos. O fenótipo de um modelo de rato knock-out Cmah pode ser avaliado isolando e analisando a composição de ácidos siálicos em amostras de fígado ou leite. Vários métodos para a detecção de ácidos siiálicos em tecidos animais foram relatados anteriormente: reagir ácidos siálicos com resorcinol 11 ou ácido tiobarbitúrico 12 resultam na formação de um produto cromóforo e podem ser simplesmente analisados usando uma configuração baseada em platereader, mas apenas o sialico total O teor de ácido pode ser determinado. Alternativamente, a análise de ácidos siálicos também foi descrita utilizando cromatografia em fase gasosa13 , espectrometria de massa MALDI-ToF 14 ou métodos amperométricos 15 . No entanto, os métodos de análise de ácido siálico mais comummente aplicados são baseados em liberação hidrolítica, seguidos de derivação de fluorescência e subsequente cromatografia líquida de alto desempenho 16 , 17 , 18 .
O protocolo aqui apresentado permite a avaliação fenotípica de camundongos knock-out Cmah homozigotos, analisando e quantificando as quantidades relativas de Neu5Gc de amostras de leite e fígado. A análise foi realizada usando uma configuração padrão de HPLC com detecção de fluorescência. O passo mais crítico deste procedimento é a preparação das colunas de troca de aniões e a realização da cromatografia de troca de aniões; Para resolver adequadamente a resina e para coletar as frações corr…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação de Ciências Naturais da China (números de subvenção 31471703, A0201300537 e 31671854 para JV e LL) e o Plano de 100 Estratos Estrangeiros (número de concessão JSB2014012 a JV).
Chemicals: | |||
N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
Tools/Materials: | |||
3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
HPLC Analysis: | |||
High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |