אנו מספקים פרוטוקולים פשוטים וחזקים לעיבוד חומר ביופסיה של מינים שונים, עוברים של אורגניזמים מודל ביו-רפואי ודגימות של רקמות אורגניות אחרות על מנת לאפשר דיגיטלי נפח נתונים הדור עם ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית האפיסקופיים שיטה.
אנו מספקים פרוטוקולים פשוטים להפקת נתונים נפח דיגיטלי עם ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית האפיסקופית (HREM) שיטה. HREM מסוגל הדמיה חומרים אורגניים עם כרכים עד 5 x 5 x 7 מ"מ 3 ברזולוציות מספריים טיפוסי בין 1 x 1 x 1 ו 5 x 5 x 5 מיקרומטר 3 . דגימות מוטמעים שרף methacrylate ו חתך על microtome. לאחר כל קטע תמונה של משטח לחסום נתפס עם מצלמת וידאו דיגיטלית שיושב על phototube מחובר הראש מיקרוסקופ המתחם. הציר האופטי עובר דרך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) קוביית מסנן והוא מיושר עם עמדה, שבה זרוע מחזיק בוק מגיע לנוח אחרי כל מקטע. בדרך זו, סדרה של תמונות מיושרות מיסודו מיושר, הצגת משטחי בלוק הבאים מיוצרים. טעינת סדרת תמונות כזו בתוכנת הדמיה תלת מימדית (3D) מאפשרת המרה מיידית לנתוני נפח דיגיטלי, המאפשרים וירטואליזציהEctioning שונים מטוסים אורתוגונליים ו אלכסוני ויצירת נפח ו משטח המחשב שניתנו מודלים. אנו מציגים שלושה פשוטים, רקמות ספציפיות רקמות לעיבוד קבוצות שונות של דגימות אורגניות, כולל עכבר, אפרוח, שליו, צפרדע ועופות זברה דגים, חומר ביופסיה האדם, נייר uncoated והחלפת העור החומר.
ניתוח מבני של חומרים אורגניים ואנאורגניים הוא הצעד הראשון בהבנת התכונות הפיזיות שלהם ותפקודם. הבסיס לאנליזה כזו הוא מידע דו מימדי (2D) שנרכש על ידי התבוננות זהירה בקטעים היסטולוגיים, עם מגוון שיטות דימות פשוטות ומתוחכמות המפיקות פרטים על ארכיטקטורת רקמות, מורפולוגיה של תאים וטופולוגיה, הרכב מולקולרי ותכונות ביומכניות 1 , 2 , 3 . עם זאת, מידע דו-ממדי אינו מתאים לחקר הסדרים מורכבים מרחביים. לפיכך מספר גדל והולך של vivo ו vivo שיטות לשעבר המאפשרים את הדור של נפח נתונים דיגיטליים הוקמו בעשורים האחרונים 4 ועוד רבים נמצאים בפיתוח.
העיקרון השיטתי של רוב שיטות הדור נתונים הוא הדור של ערימות וירטואליותשל תמונות דיגיטליות המציגות קטעים שנרכשו על ידי חתך וירטואלי או פיזי של אובייקט. אם תמונות הקטעים מיושרות כהלכה, הדבר יוצר אמצעי אחסון, וניתן לחלק אותו מחדש במטוסי מקטע וירטואלי, או להשתמש בו ליצירת מודלים תלת-ממדיים של שטח ונפח. טכניקות פופולריות לדמיין בני אדם ודגימות ביולוגיות גדולות יותר הם טומוגרפיית תהודה מגנטית (MRT), טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) וטומוגרפיה ממוחשבת של פוטון בודד (SPECT). הדגימות הקטנות מדמיינות בדרך כלל באמצעות הדמיית תהודה מיקרו-מגנטית (μMRI), טומוגרפיה של הקרנת אופטי (OPT), טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית (OCT), טומוגרפיה פוטוקוסטית (PAT), שיטות היסטולוגיות המבוססות על חתכים היסטוריים, מיקרוסקופיה קונפוקלית וטומוגרפיה אלקטרונית 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 <sUp>, 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
טכניקה חדשה יחסית ליצירת נתונים, המייצרת נתונים דיגיטליים של דגימות קטנות ודגימות רקמות היסטולוגיות, היא שיטת ה- HREM, שפותחה בשיתוף פעולה הדוק עם טים מוהון 18 , 19 . זוהי טכניקה פשוטה המבוססת מיקרוסקופ, אשר מייצר נתונים נפח דיגיטלי של חומר מוטבע שרף כי הוא מחולק על microtome. הנתונים מאפשרים ניתוח מפורט של ארכיטקטורת רקמות והפצות התא, כמו גם ניתוח מטרי של תכונות קטנות על רמת מיקרוסקופית אור ביניים.
HREM מייצרת ערימות של תמונות דיגיטליות מיושרות מטבען המופיעות כאילו נלכדו מ- eאוסטין חלקים היסטולוגיים מוכתמים. ניגודיות רקמות ונתונים ברזולוציה ביחס שדה הראייה עולה על הנתונים של מיוצר עם μCT, μMRI, ו OPT, אבל הם נמוכים יותר מאשר זה אפשרי עם confocal, גיליון אור מיקרוסקופית אלקטרונים 20 . עם זאת, בניגוד האחרון, HREM מסוגל לדמיין דגימות עם נפח גדול יחסית של עד 5 x 5 x 7 מ"מ 3 באיכות היסטולוגית. מספר מחקרים שנעשו לאחרונה מספקים אפיונים מפורטים והשוואות בין היתרונות והחסרונות של טכניקות ההדמיה הבודדות, ולשם האובייקטיביות אנו מתייחסים לאלו הנוגעים למידע נוסף על מגבלותיהם ותחומי היישומים האפשריים 4 , 21 , 22 , 23 , 24
מחקר זה מתמקד בשיטת הדמיה של HREM ומטרתו לספקפרוטוקולים פשוטים מאוד להפקת נתונים HREM של קשת רחבה של חומרים אורגניים, כמו גם דוגמאות של היישום שלהם. זרימת העבודה ליצירת נתונים HREM הוא פשוט חל על כל החומרים שיכולים להטביע שרף methacrylate ( איור 1 ). עם זאת, ישנם הבדלים ספציפיים רקמות בהכנת המדגם, כי צריך להיחשב. לכן אנו מספקים שלושה פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת דוגמאות שונות. הטמעה והפקת נתונים פרוטוקול השלבים זהים עבור כולם.
HRM היא שיטה מיקרוסקופית חזקה ביותר, אשר אידיאלית לחזות מגוון רחב של חומרים אורגניים המשמשים ביו-רפואה ותעשייה 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . זה יכול להיות מועסק כמודל הדמיה בלעדי, כפי המשמש כיום על ידי מנגנוני הפרעות התפתחותיות (DMDD) תוכנית 41 , 42 <suP, 43 , 44 , או כחלק אינטגרטיבי של צינורות הדמיה multimodal 45 .
ניתן לתפקד במנגנון מלא של ייצור נתוני ה- HREM, המרכיבים את רכיבי המעבדה הקונבנציונאליים, וכולל מיקרו-טום ממונע, מיקרוסקופ, טבלת צלב ממונע, מחשב עם תוכנה מתאימה 25 . זה קריטי להשתמש microtome מצויד בעל בלוק כי reproducibly מפסיק לאחר כל קטע במיקום מוגדר קוביות GFP מסנן בתוך המסלול האופטי. עם זאת, מלא תפקוד כלול פתרונות ניתן לרכוש מחברות כגון אינדיגו מדעי.
HREM פונה למגבלות כמו כל טכניקות היסטולוגית, אלא כי אין חפצים מוצגים במהלך חתך או הרכבה החלק. עם זאת, ישנן מגבלות, הנובעות מן הצורך דגימות כתם לפני חתך ומן המאפיינים של חומר הטבעה. חדירה של eosin דרך הדגימה כולה נדרש לקבלת ניגודים רקמות מספיק; חומר צפוף מאוד, רקמות שומן וחומרים אנאורגניים מעכבים ביעילות חדירת חנקן, וכתוצאה מכך ברקמות לא מוכתמות במרכז האובייקטים. שימוש מיוחד fixatives מסייע כתמי העור הכתם, אבל עדיין אין שיטה נכונה להתגבר באופן מלא על הבעיה. מגבלה נוספת היא שרפים שחוסמים יותר מ -2 ס"מ נוטים לשבור במהלך החתך. זה יכול להיות נמנע בחלקו על ידי חיתוך דגימות ועיבוד חלקים בנפרד.
מיקום נכון של דגימות קטנות או דגימות עם משטחים לא סדירים בתבניות במהלך הטבעה הוא לעתים קרובות בעייתי. כיסוי דגימות עם agarose ועיבוד בלוקים agarose כמתואר בפרוטוקול בדרך כלל פותר בעיה זו 19 . גישה חלופית, אשר גם עוזר אם בלוקים לשבור במהלך כתותOning, היא להסיר את בלוק מוקשה כבר מן המחזיק שלה להטביע אותו מחדש, בעקבות הליך הטבעה המתואר.
מערך נתונים טיפוסי של HREM כולל 500 עד 3,000 תמונות בודדות. הרזולוציה המספרי שלה נקבעת על ידי המרחק בין הדימויים הרצופים ( כלומר , לפי עובי העומק), המאפיין של יעד המצלמה, ומאפייני האופטיקה המנוצלת. השתמשנו בסעיף עובי בין 1 מיקרומטר ו 5 מיקרומטר והשיג תוצאות טובות, למרות הפרוטוקולים המוצגים לא לגמרי לחסל נוצץ מן חפצים 20 , 46 . ממצאים אלה נגרמים על ידי רקמות מוכתמת עמוק הממוקם עמוק בתוך הבלוק, וכתוצאה מכך טשטוש של מידע רקמות על משטחים לחסום על ידי.
המצלמות היו מימדים היעד של 2,560 x 1,920 פיקסלים 2 , 2,048 x 2,048 פיקסלים 2 , ו 4,096 x 4,096 פיקסלים 2 ו היו combiעם עדשות 1.25X, 2.5X, 5X, 10X ו 20X. זה הביא גדלים פיקסלים מספריים בין 0.18 x 0.18 מיקרומטר 2 ו 5.92 x 5.92 מיקרומטר 2 , אשר הוכיח להיות מספיק לניתוח 3D של ארכיטקטורת רקמות וצורות התא, ואפילו עבור חזותי גרעינים. בהתחשב ברזולוציה נומרית גבוהה, אחרים organelles התא צריך להיות גלוי גם כן. בניגוד מספיק בשל מכתים eosin פשוט, ואת התכונות האופטיות של מטרות להפחית באופן דרמטי את האפשרות להפלות מבנים. רזולוציה מרחבית אמיתית מקסימלית של נתוני HREM, אשר לוקח בחשבון את הצמצם המספרי, הוא כ 1 x 1 x 1 מיקרומטר 3 , ולכן רק מאפשר אפליה יעילה של מבנים גדולים יותר מאשר על 3 x 3 x 3 מיקרומטר 3 .
בעיה נפוצה לכל טכניקות הדמיה דיגיטליות היא הפער בין גודל שדה הראייה, המגדיר את החלק של הדגימה שניתן להציגD על היעד המצלמה, ואת הרזולוציה המספרי של התמונה. ככל ששדה הראייה גדול יותר, כך הרזולוציה המרבית האפשרית המרבית 46 . הגדרת HRM המשמשת כאן מאפשרת את יצירת נתוני HREM עם שדה תצוגה בין 0.74 x 0.74 מ"מ 2 (המטרה 20X) המוצגים ברזולוציה נומרית של 0.18 x 0.18 מיקרומטר 2 ו 12.12 x 12.12 מ"מ 2 (1.25X אובייקטיבי) המוצגים ב רזולוציה נומרית של 2.96 x 2.96 מיקרומטר 2 . חלופות מסחריות חלופיות יכולות לספק שדות גדולים יותר של תצוגות, אך במחיר של רזולוציה אמיתית. עם זאת, הם מספקים תוצאות מצוינות, כפי שניתן לראות מן הנתונים המוצגים בדף הבית של תוכנית DMDD 47 .
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים טים מוהון על תרומות שלו invalubale בפיתוח HREM ו פטרה חפר למתן דוגמאות.
JB-4 Plus Embedding Kit | Polysciences Europe GmbH | 18570-1 | includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B |
Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177A-3 | |
Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177C-3 | |
JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences Europe GmbH | 15899-50 | |
Eosin | Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma | 1A-196 | |
Microtec CUT 4060E | rotary microtome | ||
Leica DM LM, fluorescence compound microscope | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
GFP filter set | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | 11090937180000 | |
Motorised cross table | Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG | KT5-LSMA | |
Digital video camera SPOT-FLEX | Visitron Systems GmbH. | ||
precisExcite High-Power LED | Visitron Systems GmbH. | light source | |
VisiView 2.1.4 | Visitron Systems GmbH. | Image capturing software | |
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
KL 2500 LCD | Schott AG | light source |