Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique
Summary
Combinaison Ivacaftor et ivacaftor-lumacaftor sont deux nouveaux médicaments CF. Cependant, il y a toujours un manque de compréhension sur leur pharmacocinétique/pharmacodynamique et pharmacologie. Nous présentons une technique HPLC-MS optimisée pour l’analyse simultanée d’ivacaftor et ses principaux métabolites et lumacaftor.
Abstract
Défauts dans le régulateur de la conductance membranaires de la fibrose kystique (CFTR) sont la cause de la fibrose kystique (FK), une maladie dont les manifestations pulmonaires mortelles. Ivacaftor (IVA) et combinaison ivacaftor-lumacaftor (luminance) sont deux nouveaux médicaments pour percée CF directement modulent l’activité et le trafic de la protéine CFTR défectueuse. Cependant, il y a toujours un manque de compréhension sur les paramètres pharmacocinétiques/pharmacodynamiques et la pharmacologie des ivacaftor et lumacaftor. La technique HPLC-MS pour l’analyse simultanée des concentrations d’ivacaftor hydroxyméthyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate et lumacaftor dans les liquides biologiques chez les patients recevant la combinaison standard d’ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor la thérapie a été développé par notre groupe et partiellement validé aux normes FDA. Toutefois, pour permettre l’analyse de haut débit d’un grand nombre d’échantillons de patients, notre groupe a optimisé la méthode signalée par l’utilisation d’une colonne de chromatographie en phase inverse de taille pores plus petite (2,6 µm, C8 100 Å ; 50 x 2.1 mm) et un système de solvants dégradé ( 0-1 min : 40 % B ; 1-2 min : 40-70 % B ; 2-2,7 min : tenue à 70 % B ; 2.7-2,8 min : 70-90 % B ; 2.8-lavage de 4,0 min : 90 % de B ; 4.0-4,1 min : 90-40 % B ; 4.1-6.0 min : tenue à 40 % B) au lieu d’une élution isocratique. L’objectif de cette étude était de réduire le temps d’analyse HPLC-MS par exemple spectaculaire de ~ 15 min à seulement 6 min par échantillon, ce qui est essentiel pour l’analyse d’une grande quantité d’échantillons de patients. Ce moyen de communication sera très utile pour les études sur les relations exposition-réponse de ces médicaments de CF révolutionnaires.
Introduction
Fibrose kystique (FK) est une maladie génétique commune impliquant les glandes exocrines de mucus du poumon, foie, pancréas et les intestins causant la rupture progressive de plusieurs organes, comme une diminution de la fonction pulmonaire et une insuffisance pancréatique1, 2,3. Ivacaftor (IVA) est le premier aliment et Drug Administration (FDA-US) et l’Agence européenne des médicaments (EMA) a approuvé la fibrose kystique membranaires conductance regulator (CFTR) potentialisateur, dont l’efficacité clinique en témoigne, produisant une importante amélioration de la fonction pulmonaire au placebo chez un petit sous-groupe de patients atteints de mucoviscidose portant le G551D-CFTR [glycine (G) en position 551 est remplacé par l’acide aspartique (D)] mutation faux-sens (~ 4 à 5 % de l’effectif des FC)4,5. Cela administré par voie orale drogue augmente le canal CFTR ouvrir, donc augmenter le flux d’ions chlorure et agissant sur le défaut principal qui mène aux manifestations cliniques de CF4,6. Malheureusement, IVA en monothérapie n’est pas efficace chez les patients avec la plus commune mutation homozygote de F508del [dans une délétion du gène CFTR qui entraîne la perte de la phénylalanine (F) en position 508 cadre] qui se traduit par CFTR mal repliée, ce qui est vu dans environ 50 % des le CF population7,8.
Récemment, la FDA a accordé l’homologation permettant de combiner IVA avec le correcteur CFTR drogue lumacaftor. L’habile stratégie de combiner un correcteur CFTR (lumacaftor, LUMA) qui sauve F508del-CFTR à la surface de la cellule avec un modulateur (IVA) qui potentialise l’activité du canal CFTR, étendre efficacement la fenêtre de traitement à la plupart de la population de CF5 . Des questions subsistent sur la question de savoir si ces médicaments seront engage réaliser comme un certain nombre de rapports contradictoires est apparues que jeté le doute sur leur efficacité clinique9,10. En outre, amélioration des fonctions pulmonaires ont été modeste (2,6-4 % seulement pour combinaison ivacaftor-lumacaftor) par rapport aux succès obtenus avec IVA en monothérapie chez les patients ayant une mutation (10,6-12,5 %) de G551D8. Des interactions de médicaments antagonistes entre IVA et LUMA qui limitent potentiellement l’efficacité clinique d’ivacaftor-lumacaftor Association viennent de ses propriétés pharmacocinétiques moins qu’idéales7,11. IVA est fortement métabolisée par les enzymes du cytochrome P450 (CYP), principalement à un métabolite actif hydroxyméthyl-IVA (IVA-M1, M1) et une forme inactive IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)7,12. L’inducteur du CYP3A4 LUMA, en revanche, n’est pas métabolisée et est principalement excrétée inchangée dans les fèces11. Comme inducteurs du CYP3A4 induisent le métabolisme du cytochrome, pourraient ramener les concentrations d’ivacaftor (substrat du CYP3A4). En outre, IVA et la luminosité sont des molécules très hydrophobes et sont ~ 99 % liée aux protéines plasmatiques, ce qui limite considérablement le médicament (actif) gratuit concentration1,13.
Collectivement, ces facteurs peuvent venir ensemble pour limiter l’efficacité clinique de la combinaison de l’ivacaftor-lumacaftor. On ne sait pas si les concentrations plasmatiques optimale sont atteints dans la posologie actuelle pour combinaison ivacaftor-lumacaftor, ou si le seuil thérapeutique est maintenu8. Actuellement, il y a un manque d’informations concernant les paramètres pharmacocinétiques tels que le pic et les concentrations plasmatiques de l’état d’équilibre d’ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor. Compte tenu du métabolisme a noté des ivacaftor et lumacaftor, suivi des relations exposition-réponse est nécessaire pour atteindre les posologies optimales pour la thérapie ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor. Notre groupe a récemment publié la première méthode CLHP/SM-pour le suivi des relations exposition-réponse de l’IVA et LUMA14. Aucune des techniques alternatives de mesurer les concentrations d’ivacaftor, de ses métabolites et lumacaftor n’ont été signalés à ce jour. Pour permettre l’analyse de haut débit d’un collectif plus grand de patients et de réduire considérablement les temps d’analyse, notre groupe a optimisé la méthode signalée par l’utilisation d’une colonne de chromatographie en phase inverse de taille pores plus petite et un système de solvants dégradé qui réduit le coût et le temps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme indiqué précédemment, notre groupe a pour la première fois élaboré et validé une méthode HPLC et LC-MS pour une détection rapide et la quantification de l’ivacaftor et ses principaux métabolites M1 hydroxyméthyl-IVA (active) et IVA-carboxylate M6 (inactif) ; et lumacaftor dans le plasma et les expectorations de CF patients14. Le dosage indiqué par notre groupe précédemment a été utilisé avec succès pour quantifier la concentration de LUMA, IVA, IVA-M1 et IVA-M6 dans le p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L. et T.V. sont pris en charge par le National Institute of Allergy et maladies infectieuses (NIAID) de la National Institutes of Health (R01 AI111965). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l’Institut National des allergies et maladies infectieuses ou les National Institutes of Health. MC est un chercheur australien NHMRC Principal. J. L. est un Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Research Fellow et T.V. est un australien NHMRC industrie carrière développement niveau 2 Research Fellow. E.K.S est un nommé 2017 jeune Ambassadeur pour ASM (American Society for Microbiology) et est supporté par l’Australian Postgraduate Award.
Certaines parties de ce travail a été présenté à la 12ème Conférence d’Australiasien sur la fibrose kystique à Melbourne (5-8ème d’août 2017).
Materials
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
Referencias
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