Drie-dimensionale reconstructie van de vasculaire architectuur van de passieve duidelijkheid-gewist muis eierstok
Summary
Hier presenteren we een aanpassing van de passieve duidelijkheid en 3D reconstructie methode voor visualisatie van de ovariële therapieën en folliculaire haarvaten in de eierstokken intact muis.
Abstract
Het vruchtbeginsel is het belangrijkste orgaan van het vrouwelijke voortplantingsstelsel en is essentieel voor de productie van de vrouwelijke gameten en voor de controle van het endocriene systeem, maar de complexe structurele relaties en driedimensionale (3D) therapieën platforms van de eierstok zijn niet goed beschreven. Om te visualiseren de 3D verbindingen en de architectuur van de bloedvaten in de intact eierstok, is de eerste belangrijke stap om de eierstok optisch duidelijk. Ter voorkoming van weefsel krimp, gebruiken we de hydrogel fixatie gebaseerde passieve duidelijkheid (duidelijk lipide-uitgewisseld Acrylamide-gekruist Rigid Imaging / immunokleuring/In situ-hybridisatie-compatibele weefsel Hydrogel) protocol van de methode om te wissen van een intact eierstok . Immunokleuring, geavanceerde multiphoton confocale microscopie en 3D-beeld-reconstructies werden vervolgens gebruikt voor de visualisatie van ovariële vaartuigen en folliculaire haarvaten. Met behulp van deze aanpak, we toonden een significante positieve correlatie (P < 0.01) tussen de lengte van de folliculaire haarvaten en het volume van de folliculaire muur.
Introduction
De follikel is de fundamentele structurele en functionele eenheid van de eierstok en de ontwikkeling ervan is sterk gerelateerd aan de therapieën in de eierstok. Bloedvaten, voeding en hormonen aan de follikels leveren en dus spelen een belangrijke rol in de groei en de rijping van de follikels1.
Een combinatie van technologieën, met inbegrip van bloedvat selectieve markeringen, transgene muismodellen, en farmaceutische ontwikkeling, is onze kennis over ovariële vasculaire netwerken, angiogenese, en de functie van bloedvaten in gestegen folliculogenese. Het vruchtbeginsel is bekend als een actieve orgel omdat het hervormt verschillende weefsels en vasculaire netwerken tijdens folliculogenese en ovulatie. Dergelijke actieve remodelleren in de omvang en de structuur van schepen is vereist voor de biologische functie van de ontwikkeling en het werven van follikels.
Traditionele histologische en histomorphometric methodes gebruikend ovariële secties en immunolabeling van de bloedvaten zijn beperkt tot tweedimensionale (2D) afbeeldingen,2. Met de ontwikkeling van driedimensionale (3D) reconstructie technologieën, kunnen 2D beelden van weefsel segmenten overlappen zodat een 3D-structuur, maar deze methode heeft nog steeds enkele beperkingen — afdelen van het weefsel kan vernietigen de microstructuren, sommige delen van de weefsel ontbreken vaak, en belangrijke arbeid is betrokken bij het maken van 3D-reconstructies van de beelden verkregen uit segmenten. Geheel-weefsel 3D-beeldbewerking met confocale microscopie kan veel van deze beperkingen overwinnen, maar deze methoden zijn beperkt tot de evaluatie van de angiogenese in het embryonale eierstok3. Met behulp van hele weefsel clearing methoden zoals duidelijkheid4 kan verhogen het gevisualiseerde volume zodat deze problemen in de postnatale en volwassen eierstokken en dergelijke methoden bieden optische Goedkeuringvande het ovarium zonder eventuele structurele vervormingen. Beeldvorming van de 3D-architectuur van de eierstokken intact biedt een nauwkeurige afbeelding database voor analysesoftware van de afbeelding, zoals het Imaris softwarepakket gebruikt in dit werk.
Verbouwing van het ovarium tijdens volwassenheid is onderdeel van een dynamische fysiologische systeem, en dit maakt het ovarium een uitstekend model voor onderzoek naar de regulering van angiogenese. Evaluatie van de rol van ovariële bloedvaten in pathologische omstandigheden van het vrouwelijke reproductieve systeem zoals polycysteus ovarium syndroom of ovariële kanker kan bovendien worden bestudeerd door hele eierstokweefsel imaging. De ontwikkeling van de passieve duidelijkheid-methode en het gebruik van de software van de analyse van de geavanceerde beeld hebben gedetailleerde ruimtelijke informatie verstrekt over de relaties tussen de bloedvaten en ovariële structuren zoals follikels.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de huidige studie presenteren we 3D-imaging om te evalueren van de relaties tussen de haarvaten en individuele groeiende follikels. In onze vorige werk met behulp van de dezelfde protocol 9, studeerde we de rol van grote therapieën, interacties tussen follikels en de locatie van de follikels in de eierstokken intact muis. De passieve houding van de duidelijkheid ons toegestaan om te studeren van micro – en macro-vasculatures, folliculogenese en de relaties tussen de corpora lutea en de follike…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Chinese speciale fonds voor Postdocs (nr. 2014T70392 aan de YF), de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 81673766 aan de YF), het nieuwe leraar Priming Fonds, de oprichting van de Zuoxue van Fudan Universiteit en de ontwikkeling Project van Shanghai piek Disciplines-integratieve geneeskunde (20150407).
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
Referencias
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 – 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
