Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula
Summary
Uma nova geração de plataformas de transcrição-tradução livre de célula foi projetada para construir sistemas bioquímicos em vitro através da execução de circuitos de gene. Neste artigo, descrevemos como bacteriófagos, como MS2, ΦΧ174 e T7, são sintetizados a partir de seu genoma usando um Escherichia coli célula livre todos os sistema de TXTL.
Abstract
Uma nova geração de sistemas sem célula transcrição-tradução (TXTL), projetado para ter uma maior versatilidade e modularidade, fornecer novos recursos para executar ciências básicas e aplicadas em reações de tubo de ensaio. Na última década, sem célula TXTL tornou-se uma técnica poderosa para uma ampla gama de biologia relacionados quantitativa e sintético de pesquisa multidisciplinar romance áreas. As novas plataformas TXTL são particularmente úteis para construir e interrogar os sistemas bioquímicos através da execução de circuitos de gene sintético ou natural. In vitro TXTL provou conveniente rapidamente elementos reguladores do protótipo e redes biológicas, bem como para recapitular molecular auto-montagem mecanismos encontraram em sistemas vivos. Neste artigo, descrevemos como infecciosos bacteriófagos, tais como MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) e T7 (dsDNA), são sintetizados inteiramente do seu genoma em um pot-reações usando um todos Escherichia coli, célula livre sistema TXTL. Síntese dos três coliphages é quantificada utilizando o ensaio da chapa. Mostramos como o rendimento do fago sintetizado depende das configurações bioquímicas das reações. Apinhamento molecular, emulado por uma concentração controlada de PEG 8000, afeta a quantidade de fago sintetizado por ordens de magnitude. Descrevemos também como amplificar os fago e como purificar seus genomas. O conjunto de protocolos e resultados apresentados neste trabalho deve ser de seu interesse multidisciplinares pesquisadores envolvidos em Bioengenharia e biologia sem célula sintética.
Introduction
Na última década, a tecnologia de célula livre expressão foi projetada para aplicações de romance endereço em biologia relacionadas a sintética e quantitativos de investigação multidisciplinar emergente áreas. Originalmente usado para expressar proteínas independentes de um organismo vivo, novos sistemas TXTL sem célula foram desenvolvidos para ambas as ciências básicas e aplicadas1,2, ampliar consideravelmente o alcance desta tecnologia. A nova geração de plataformas TXTL foi projetada para ser amigável, mais eficiente (atingindo 2 mg/mL de síntese de proteínas em modo de lote3), a mais versátil a nível de transcrição4e modular para integram facilmente romance natural ou funções sintéticas expandir as capacidades existentes sistemas biológicos5,6. Em particular, sistemas TXTL sem célula tornaram-se útil para a prototipagem rápida de programas genéticos, tais como elementos reguladores ou pequenos circuitos genéticos7,8,9, reduzindo o projeto-compilação-teste a alguns dias do ciclo. Notavelmente, os novos sistemas TXTL também são capazes de processar grandes programas de DNA como a síntese completa de coliphages10,11, demonstrando forte suficiente performances para apoiar a reconstituição da genômica ativo DNA codificado entidades vivas.
Sistemas TXTL apresentam muitas vantagens técnicas em relação ao tradicional em vitro construtivo ensaios bioquímicos. TXTL sem célula vincula o processo de expressão gênica ao produto final em um ambiente aberto e reduzido, em oposição ao complexo citoplasma de uma célula viva. TXTL usa DNA para reconstruir sistemas bioquímicos em vitro, que, com modernas técnicas de montagem de DNA, é acessível e rápido além de não exigir etapas de purificação de proteínas fastidioso. Expressão sem célula fornece acesso direto a maioria dos componentes nas reações bioquímicas, permitindo assim uma dissecação mais profunda das interações moleculares12. Em uma reação TXTL, um pode alterar as configurações de bioquímicas e biofísicas à vontade, que é quase impossível em uma célula viva. Dadas essas vantagens e melhorias recentes, a tecnologia TXTL está se tornando cada vez mais popular como uma plataforma alternativa para a biologia sintética e quantitativa. Enquanto a comunidade de pesquisa usando TXTL está crescendo rapidamente e TXTL está se tornando uma tecnologia padrão em bioengenharia, é essencial para entender como usar tais plataformas a fim de desenvolver práticas adequadas relacionadas com a execução de reações TXTL e para a interpretação dos resultados.
Neste artigo, descrevemos como usar um sistema TXTL de e. coli todos para sintetizar, em um pot-reações, bacteriófagos de seu genoma11, tais como MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) e T7 (dsDNA, 40 kb). Mostramos como a quantidade do fago sintetizado as alterações em relação a algumas das configurações de bioquímica das reações (concentração de magnésio e potássio). Apinhamento molecular, emulado por uma gama de PEG 8000 concentrações, tem um efeito dramático na síntese do fago sobre várias ordens de grandeza. A realização desses grandes sistemas bioquímicos em reações de único tubo de ensaio que recapitular simultaneamente os processos de transcrição, tradução e self-assembly, é interessante para abordar questões básicas relacionadas com a biologia e biofísica 10 (regulação gênica auto-montagem), bem como para desenvolvimento de aplicações, tais como a redefinição de funções do fago para construir novas nanoestruturas13. Além de um prático em TXTL, nós fornecemos métodos para amplificação do fago, extração de genoma e purificação e quantificação do fago por ensaio da chapa. Os métodos apresentados neste manuscrito são adequados para os investigadores que utilizam sistemas de célula livre extrato com base em Escherichia coli e estão interessados em bacteriófagos.
Os protocolos apresentados neste trabalho podem ser resumidos como segue: amplificação do fago 1) (1 dia: preparar inoculação células, dia 2: única placa, o crescimento do fago, múltiplas e concentração e dia 3: purificação do fago), 2) extração de DNA dupla-hélice do genoma (extração fenol/clorofórmio) e 3) sem célula reação do fago e experimento de título (1 dia: células hospedeiras da placa e fazer placas de ágar, dia 2: reação celular livre e anfitrião de células pré-cultura e dia 3: título de cultura e do fago de célula hospedeiro).
Protocol
Representative Results
Discussion
Seguindo a técnica em Chen, et al 14 para SPMC, um passo crítico é atingido quando determinar condições adequadas para o superinfeção. O parâmetro que controla a capacidade de uma estirpe hospedeiro para resistir a superinfeção mais estreitamente com frequência é a concentração inicial do fago infectante. As células hospedeiras devem estar em fase de crescimento logarítmico antes da infecção inicial, com uma pequena quantidade do fago. Eventualmente, a Praga também alca…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material é baseado no trabalho suportado pelo escritório de pesquisa Naval prêmio número N00014-13-1-0074 (V.N.), o programa de ciência de fronteira humana conceder número RGP0037/2015 (a V.N.), e a Fundação científica Binacional conceder 2014400 (V.N.).
Materials
| Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| Conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
| Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
| Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
| LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller – Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company – product number 214010). |
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