Optische Cross-sectional Muskel Bereich Bestimmung von Drosophila Melanogaster Erwachsenen indirekten Flugmuskeln
Summary
Wir berichten über eine Methode, um Muskelgebiet, zu quantifizieren, ist eine indirekte Methode Muskelmasse bei Drosophila Erwachsenen bestimmen. Wir demonstrieren die Anwendung unserer Methode durch die Analyse des indirekten Flugs in einem Drosophila -Modell myotonische Dystrophie Krankheit Muskeln.
Abstract
Muskelmasse zu verlieren, ist bekannt als Muskelatrophie, einen gemeinsamen Phänotyp in Drosophila -Modellen der neuromuskulären Erkrankungen. Wir haben die indirekten Flugmuskeln (Schnittstellenmodule) fliegen, speziell der dorsal-Längsmuskeln (DLM), als die experimentelle gegen die verwendet, die atrophische Phänotyp durch unterschiedliche genetische Ursachen herbeigeführt. In diesem Protokoll beschreiben wir fliegen Thorax Muskeln für halb dünn schneiden einbetten, das einen guten Kontrast zwischen Muskel und das umgebende Gewebe zu erhalten und das optische Mikroskopbilder für halbautomatische Erfassung von quantifizierbaren Daten verarbeiten und Analyse. Wir beschreiben drei spezifische Anwendungen der methodischen Pipeline. Zunächst zeigen wir, wie die Methode angewendet werden kann, um Muskeldegeneration in einem myotonische Dystrophie Fly Modell zu quantifizieren; Zweitens helfen Messung der Muskel Querschnittsfläche, um Gene zu identifizieren, die entweder zu fördern oder zu, Muskelatrophie und/oder Muskeldegeneration verhindern; Drittens kann dieses Protokoll angewendet werden, um festzustellen, ob eine Kandidatenverbindung in der Lage, einen bestimmten atrophischen Phänotyp, induziert durch eine ursächliche Mutation wesentlich zu ändern istoder durch ein Umwelt-Trigger.
Introduction
Der Thorax der Fruchtfliege enthält zwei verschiedene Klassen von Flugmuskeln, die funktionell, physiologisch und anatomisch unterscheiden. Diese Muskeln sind: die indirekten Flugmuskeln (IFM), die von dorsal längs (DLM) und dorsal-Ventral (DVM) Muskeln (Abbildung 1) und die synchrone Flug bestehen Steuern Muskeln1,2. Diese Muskeln erzeugen zusammen die erhöhte mechanische Leistung für Flug benötigt. Die Größe, Verteilung und Rostro-kaudalen Disposition der die Schnittstellenmodule ermöglichen eine einfache Orientierung für transversale Stationspunkte3 (Abbildung 2A). Aus diesem Grund haben wir diese Muskeln, Muskelatrophie in Drosophila Melanogasterstudieren ausgewählt.
Abbildung 1: Diagramm des Thorax der Fruchtfliege zeigen die indirekten Flugmuskeln (Schnittstellenmodule) Anordnung. (Links) stellt eine seitliche Ansicht und (rechts) repräsentiert einen Querschnitt des Thorax. Die Schnittstellenmodule bestehen der dorsal längs (DLM) Muskeln (in rot) und dorsal-Ventral (DVM) Muskeln (in grün).
Erhaltung der Gewebestruktur und die Kontrolle über dorsal-Ventral Achsenausrichtung der histologischen Abschnitte sind entscheidend für die richtige Beurteilung der Muskel Querschnittsfläche gewährleisten zu können. Muskelstruktur erhalten wir eine Fixierung Mischung geändert von Tomlinson Et Al. verwendet 4 . Weil Muskeln inneren Geweben, ist die Dichtheit der DrosophilaExoskelett übrigens ein Problem als Fixierung, die Mischungen auf das Zielgewebe nicht durchdringen können. Um dieses Problem zu umgehen, entfernen wir fliegen Kopf, Beine, Flügel und die letzten beiden Segmente des Abdomens Bohrungen erstellen, die die Fixierung Mischung geben darf. Im Rahmen des Protokolls Fixierung wir Behandlung mit Osmium ausgefällt (OsO4)5, die ausgiebig wegen seiner Fähigkeit verwendet wird enthalten, um Fette zu beheben, einschließlich der Triglyceride. OsO4 bewahrt die meisten Strukturen sehr gut, vor allem auf die zytologische Ebene und zur gleichen Zeit bietet einen Kontrast zu dem Bild. Nach der Fixierung waren Drosophila Thoraces im Harz für transversale semi-dünne Stationspunkte (1,5 µm) eingebettet. Für verbesserten Kontrast kann Gewebe zusätzlich mit Toluidin blau gefärbt werden. Bilder der kompletten Thoraces wurden bei 10 X und Muskelgebiet wurde durch binarizing Bilder (mit gleichen Abmessungen) und Quantifizierung der Prozentsatz der Pixel, die Muskelgewebe (schwarze Pixel) von insgesamt, mit ImageJ Software quantifiziert.
Veränderungen auf die Gewebe Vorbereitung und Fixierung Mischungen, wie der Anstieg der Konzentration von OsO4 und Glutaraldehyd-Lösung eingeführt, die in diesem Protokoll erlaubt einzigartige Erhaltung von Muskelgewebe. Und zwar deshalb, weil das Protokoll der Abbau und die Verformung des Gewebes, machen die hintere Analyse der Proben selbst in stark atrophischen Bedingungen im Zusammenhang mit neuromuskulären degenerativen Erkrankungen wie z. B. myotonische Dystrophie (DM) zuverlässiger vermeidet. In seiner häufigsten Form, DM Typ 1, ist diese seltene genetische Erkrankung durch erweiterte CUG Wiederholungen im myotonische Dystrophie Proteinkinase (DMPK) Abschriften herbeigeführt. Mutierte DMPK RNA Aggregate Form Ribonuclear Herde, die absondern Muscleblind-wie nukleare RNA-bindende Proteine (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) in Drosophila)6. Wir generiert eine Drosophila -Modell myotonische Dystrophie 250 CTG Wiederholungen unter den muskulösen Myosin schwere Kette Projektträger (Mhc-Gal4) zum Ausdruck zu bringen. Modell fliegen waren flugunfähige mit einem typischen “Up statt Flügel” Phänotyp und schweren Muskel Atrophie in ihre Schnittstellenmodule (Abb. 2 b). Frühere Studien, die in unserem Labor durchgeführt haben gezeigt, dass die Bestimmung des Gebiets Muskel Schnittstellenmodule ist eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung der Auswirkungen von verschiedenen chemischen oder genetische Modifikatoren der Muskelatrophie in diese Modell fliegen7. Als Beispiel erreicht Überexpression des Mbl-Isoform C fliegen mit dem Ausdruck der 250 CTG im Muskel, Wiederholungen eine Rettung Muskelgebiet, Mbl Erschöpfung durch Sequestrierung ist der auslösende Faktor in DM1 Pathogenese8 (Abbildung 2). Muskelgebiet wurde auch gerettet, nach Fütterung der DM-Modell mit Abp1, ein Hexapeptid mit bewährten Anti-DM1 Aktivität9 (Abb. 2D) fliegt.
Abbildung 2: Quantifizierung der dorsoventral Abschnitte des Erwachsenen Thoraces Harz eingebettet. (A-D) indirekten Flugmuskeln von Drosophila Melanogaster mit der angegebenen relevanten Genotypen. (A) Kontrolle fliegt (Yw). (B) Ausdruck von 250 nicht-kodierenden CTG wiederholt in der Muskulatur (UAS-CTG(250)x) verursacht eine Verringerung der Muskelgebiet im DLMs im Vergleich zur Kontrolle fliegen. (C) diese Muskel-Atrophie-Phänotyp wurde gerettet durch Überexpression des Muscleblind (MblC) (FH-CTG (250) x UAS-MblC) und (D) Fütterung die Modell-fliegen mit dem Hexapeptid Abp1 (FH-CTG (250) x Abp1). In allen Bildern ist die dorsale Seite oben. Transgene Muscle Myosin Heavy Chain Förderer (Mhc) mit vertrieben wurden-Gal4. (E) Quantifizierung der Prozentsatz der Muskelgebiet bezogen auf die Kontrolle fliegen bestätigt, dass die Unterschiede signifikant waren. Das Histogramm zeigt Mittel ± S.E.M **p< 0,01 und * p < 0,05 (Student t-Test). Maßstabsleiste: 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Die Methode, die hier berichtet wird von Interesse für Forscher mit Schwerpunkt auf Muskel-Entwicklung, Wartung und Altern, Krankheit Pathologie und Drogentests wie es zuverlässige Informationen liefert über wie Muskelgewebe auf endogene und externe Faktoren reagiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es hat sich gezeigt, dass Drosophila Melanogaster eine nützliche Modell zur menschlichen neuromuskulären Erkrankungen7,10,11, einschließlich myotonische Dystrophien, charakterisiert durch das Auftreten von Muskelatrophie. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein nützliches Instrument zur Quantifizierung der Muskeldegeneration durch das auftreten oder Fortschreiten einer bestimmten Krankheit in einem Fly Modell verur…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Mitglieder der translationalen Genomik-Gruppe und Kathryn J Hanson für die Rückmeldung und die Verbesserungen auf dieses Protokoll zu danken. Dieses Projekt erfolgte mit Forschungsstipendium SAF2015-64500-R, die europäischen Fonds für regionale Entwicklung, verliehen durch das Ministerio de Economia y Competitividad R.A umfasst.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
Referencias
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