Summary

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

Published: October 27, 2017
doi:

Summary

Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo’s, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.

Abstract

De analyse van de wereldwijde gen expressie veranderingen is een waardevol instrument voor de identificatie van nieuwe trajecten die ten grondslag liggen aan de waargenomen fenotypen. De zebravis is een uitstekend model voor snelle beoordeling van hele transcriptome van hele dieren of individuele cel populaties te wijten aan het gemak van isolatie van RNA van grote aantallen dieren. Hier wordt een protocol voor globale gen expressie analyse in zebrafish embryo’s met behulp van RNA sequencing (RNASeq) gepresenteerd. We beschrijven de voorbereiding van RNA van hele embryo’s of van cel populaties verkregen met behulp van de cel sorteren in transgene dieren. Ook beschrijven we een aanpak voor de analyse van de RNASeq gegevens om verrijkt trajecten en Ontology van het gen (ga) bedingen in global gen expressie datasets te identificeren. Tot slot bieden we een protocol voor validatie van gen expressie veranderingen met behulp van kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR). Deze protocollen voor vergelijkende analyse van controle en experimentele sets van zebrafish kunnen worden gebruikt om nieuwe gen expressie veranderingen te identificeren, en moleculaire inzicht geven in de fenotypen van belang.

Introduction

Vergelijkende analyse van de wereldwijde genexpressie is een waardevol instrument om nieuwe genen die bijdragen tot het waargenomen fenotypen te identificeren. Dergelijke analyses meestal rekenen op kwantitatieve beoordeling van transcript overvloed vergeleken tussen experimentele en controle van monsters. Gerichte aanpak, zoals qRT-PCR zijn relatief snel en nauwkeurig onderzoek van enkel gen expressie veranderingen. RNA sequencing (RNASeq) biedt een brede, hypothese-vrije benadering ter identificatie van belangrijke wijzigingen in genexpressie tussen monsters, waardoor het nu de standaard voor dergelijke onderzoeken over experimentele systemen.

Zebravis opgedoken als een prominente model op vele terreinen van de ziekte. Oorspronkelijk ontwikkeld voor hun nut in Ontwikkelingsbiologie studies, vanwege hun hoge vruchtbaarheid en relatief lage kosten van onderhoud, experimenteel gebruik van zebravis uitgegroeid tot een breed scala aan fenotypes van embryonale volwassen stadia zo goed als een breed scala van moleculaire testen1,2,3. Inderdaad, deze voordelen maken het moleculaire mechanistisch onderzoek snelle en kosteneffectieve omwille van het gemak van het verwerven van grote hoeveelheden materiaal gecombineerd met het gemak van zowel milieu als genetische manipulatie in alle stadia van het leven. Bovendien, het transparante karakter van de zebravis embryo’s en larven maken het ideaal voor het genereren van cel – en weefsel-specifieke transgene verslaggever lijnen waardoor in vivo visualisatie van discrete cel populaties4. Exploitatie van dergelijke lijnen vergunningen global gen expressie analyse in specifieke geïsoleerde celtypes gebaseerd op verslaggever genexpressie.

Hier presenteren we een uitgebreide protocol voor globale gen expressie analyse met behulp van RNASeq na cultuur van zebravis embryo’s. Genetische experimentele manipulaties, met inbegrip van morfolino (MO)-gebaseerde voorbijgaande gene knockdown of CRISPR-gemedieerde genoom bewerken, hebben ingediend elders5,6,7. We daarom concentreren op een gedetailleerd protocol voor isolatie van RNA uit hele embryo’s of gesorteerd op transgene verslaggever-uiten cellen gevolgd door eenvoudige rekenkundige analyse van de resultaten van de RNASeq met traject gereedschappen en gene ontologie (GO) voorwaarden. Tot slot hebben wij een strategie voor de validatie van gen expressie wijzigingen opgenomen door kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR). Deze protocollen zijn van toepassing op de zebravis embryo’s onderworpen aan een breed scala van experimentele omstandigheden, met inbegrip van de vergelijking van genetische mutanten of milieuomstandigheden.

Protocol

alle dierlijke protocollen hieronder zijn in overeenstemming met en goedgekeurd door de Universiteit van Maryland institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). 1. embryo voorbereiding genereren embryo’s via natuurlijke paring cultuur embryo’s tot 3 maanden van leeftijd, reproductieve volwassenheid 5 , 8 . Scheiden van de volwassen mannelijke en vrouwelijke vissen van de gewenst…

Representative Results

Sorteren van Differentially uitgedrukte genen: Om te identificeren differentially uitgedrukte genen in het larvale stadium van zebravis modellen van Alström-syndroom en syndroom van Bardet-Biedl (BBS), we gericht ofwel alms1 of afschriften van de bbs1 door het injecteren van eerder gevalideerd splice-blokkerende Mnd in wild-type zebrafish embryo’s16,17. 5…

Discussion

De in dit protocol beschreven aanpak biedt een relatief snelle en kostenefficiënte strategie voor de analyse van de transcriptome-niveau van de hele dieren of bepaalde gesorteerde cel populaties. De zebravis biedt een voordelige model voor dit soort studie vanwege het gemak en de snelheid bij het genereren van grote hoeveelheden van het starten van materiaal, het gemak van uitvoering van genetische of milieu experimentele omstandigheden, en de beschikbaarheid van een groot spectrum van transgene verslaggever lijnen waar…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) en T32DK098107 (T.L.H. en J.E.N.).

Materials

Commercial Reagents
TriZol Thermo Scientific 15596026 lysis reagent
TrypLE Gibco 12604013 dissociation buffer 1
FACSMax Genlantis T200100 dissociation buffer 2
DEPC-treated water Sigma 95284
FirstStrand cDNA conversion Thermo Scientific K1621 cDNA conversion kit
2X SYBR Green Master Mix Roche 4707516001 qRT-PCR Master Mix
FACS buffer Fisher Scientific 50-105-9042
chloroform Sigma Aldrich 288306
sodium acetate Sigma Aldrich S2889
Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish Strains
Tuebingen ZIRC ZL57
ins2a:mCherry ZIRC ZL1483
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
40 micron cell strainer Sigma CLS431750
FACS tube BD Falcon 352063
hemocytometer Sigma Z359629
Dissecting Microscope Zeiss
Inverted Microscope Zeiss
Nanodrop Thermo Scientific
Illumina HiSeq Illumina
LightCycler 480 Roche
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set Aquaneering ZHCT100
FACS tube 5 mL polypropylene tube BD Falcon 352063
Name Company Catalog Number Comments
Software
Excel Microsoft
Consensus Path DB http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO Enrichment Analysis http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis

Referencias

  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
  2. Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. . The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).
  3. Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).
  4. Detrich, H. W. . The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).
  5. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
  6. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  7. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  8. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  9. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  11. Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
  12. . IDT Primerquest Tool Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017)
  13. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  14. Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
  15. Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O’Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
  16. Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).

Play Video

Citar este artículo
Hostelley, T. L., Nesmith, J. E., Zaghloul, N. A. Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish. J. Vis. Exp. (128), e56187, doi:10.3791/56187 (2017).

View Video