Semplice eliminazione di fluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano formalina per microscopia di immunofluorescenza
Summary
Sfondo autofluorescenza dei campioni biologici complica spesso tecniche di imaging basata sulla fluorescenza, particolarmente in tessuti postmitotic umani invecchiati. Questo protocollo descrive come autofluorescence da questi campioni possa essere efficacemente rimosse utilizzando una luce disponibile in commercio che emette luce a diodi fonte a photobleach il campione prima della colorazione.
Abstract
L’immunofluorescenza è un metodo comunemente utilizzato per visualizzare compartimenti subcellulari e per determinare la localizzazione delle proteine specifiche all’interno di un campione di tessuto. Un grande ostacolo per l’acquisizione di immagini di alta qualità immunofluorescenza è endogeno autofluorescenza del tessuto causato da pigmenti di invecchiamento quali lipofuscin o da processi di preparazione del campione comuni quali fissazione dell’aldeide. Questo protocollo descrive come fluorescenza di fondo può essere notevolmente ridotto attraverso photobleaching utilizzando array di diodi (LED) prima del trattamento di luminescente fosforo bianco con sonde fluorescenti. L’emissione ad ampio spettro di fosforo bianco LED consentono per lo sbiancamento di fluorofori tutta una serie di picchi di emissione. L’apparato di photobleaching può essere costruito da componenti normalizzati a bassissimo costo e offre un’alternativa accessibile a quenchers chimici disponibili in commercio. Un photobleaching di pretrattamento del tessuto seguito da immunofluorescenza convenzionale genera immagini gratis di sfondo autofluorescence. Rispetto stabilito quenchers chimico che ha ridotto la sonda come sfondo segnali, photobleaching trattamento non ha avuto effetto sull’intensità di fluorescenza sonda mentre efficacemente ridotto fluorescenza di fondo e il lipofuscin. Anche se photobleaching richiede più tempo per il pre-trattamento, maggiore intensità LED Array può essere usato per ridurre tempo photobleaching. Questo metodo semplice potenzialmente può essere applicato ad una varietà di tessuti, tessuti particolarmente postmitotic che si accumulano lipofuscin come il cervello e i muscoli cardiaci o scheletrici.
Introduction
Microscopia di fluorescenza usando gli anticorpi proteine specifiche di targeting è abitualmente utilizzata per visualizzare le proteine di interesse nella coltura delle cellule e dei tessuti. È una complicazione importante per l’acquisizione di immagini nitide e definitive in immunofluorescenza autofluorescenza, che può essere causato in modo endogeno in tessuti di mammiferi, di età pigmento lipofuscin e di proteine come collagene ed elastina1, 2. Altre fonti di autofluorescence possono essere introdotto attraverso passaggi di preparazione del campione come aldeide fissazione3. Granelli di lipofuscin, composti principalmente da proteine oxidatively modificata e residui di degradazione dei lipidi, si accumulano nelle cellule longevi con età maggiore di2. Questo provoca difficoltà in imaging postmitotic tessuti come il cervello e muscoli cardiaci o scheletrici, come lo spettro di emissione di fluorescenza del lipofuscin è vasto e variabile, spesso in concomitanza con la lunghezza d’onda di emissione di fluorofori comune utilizzato per 4di etichettatura. Questi fattori rendono la formazione immagine del tessuto di cervello umano da casi di malattie neurodegenerative di manifestazione tardiva come degenerazione lobare frontotemporale (FTLD) particolarmente impegnativo.
Per ridurre l’autofluorescenza, abbiamo messo a punto una tecnica in cui si irradiano le sezioni di tessuto montata con una luce bianca che emettono array di diodi (LED) utilizzando una scrivania della famiglia lampada5. Questa semplice tecnica fornisce un’alternativa alle tecniche che utilizzano chimica quenchers come CuSO4 acetato di ammonio, o commercialmente disponibili tempra coloranti quali Sudan nero B e nero eriocromo T6. Ha anche un significativo risparmio di costi oltre multispettrali LED tecniche photobleaching lampada ed evita le complicazioni e gli artefatti generati da metodi di rimozione di autofluorescenza digitale come spettrale ONU-miscelazione7,8. Fosforo bianco LED hanno un ampio spettro di emissione, ad alta luminosità e basso costo di produzione, che li rende ideali come componente COTS per photobleaching una varietà di cromofori5,9.
In questo protocollo, dimostriamo la costruzione di un apparato di photobleaching utilizzando componenti accessibili e photobleaching di applicare a un caso di tessuto FTLD contenente inclusioni tau-positive (FTLD-T) utilizzando un anticorpo specifico per tau fosforilata. Dimostriamo l’effetto di photobleaching su imaging con etichetta fluorescente anticorpi che impiegano due cromofori comunemente utilizzati: Alexa 488 e Texas Red. L’effetto di photobleaching contro sezioni non trattate o quelli trattati con un quencher chimico commercio sono quantificati e rispetto. Questo pretrattamento photobleaching può essere incorporato in qualsiasi protocollo di colorazione di immunofluorescenza standard per rimuovere autofluorescence in un campione biologico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il photobleaching e pre-trattamento dei tessuti descritto in questo manoscritto permette per l’efficace eliminazione di autofluorescenza utilizzando componenti normalizzati. Il protocollo descrive la formazione immagine di immunofluorescenza degli aggregati di tau fosforilata nel tessuto formalina-fisso cervello umano usando anticorpi secondari coniugati a Alexa 488 e Texas Red, con DAPI come una colorazione nucleare. Per applicare il metodo ad altri tessuti, si consiglia di eseguire un pre-trattamento di 48 h photobleac…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto in tutto o in parte dal consorzio canadese di neurodegenerazione e invecchiamento (CCNA), l’Istituto canadese di Health Research (CIHR), la società di ALS del Canada (Canada ALS) e la società di Alzheimer del Canada (ASC). Gli autori vorrei ringraziare Luca Sultan e Andrew Reid della Maritime cervello tessuto banca per fornire tessuti cerebrali FTLD, Giordano di Milano dal programma del Targeting spazio-temporali e amplificazione della radiazione risposta (STTARR) e suoi affiliati agenzie per il tessuto incorporamento e servizi e l’avanzata ottica microscopia Facility (AOMF) per la fornitura di strumenti di microscopia di sezionamento di finanziamento. Kevin Hadley è ringraziato per la revisione critica del manoscritto.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
Referencias
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