Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico
Summary
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti in muscolo scheletrico dopo un danno mentre induce in vivo riprogrammazione. Questo metodo è adatto per valutare il ruolo della senescenza cellulare durante rigenerazione tissutale e riprogrammazione in vivo.
Abstract
La senescenza cellulare è una risposta di sforzo che è caratterizzata da un arresto della crescita cellulare stabile, che è importante per molti processi fisiologici e patologici, quali il cancro e invecchiamento. Recentemente, la senescenza è stata implicata anche nella rigenerazione e riparazione tissutale. Di conseguenza, è diventato sempre più importante per identificare cellule senescenti in vivo. Analisi di β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone) è il test più ampiamente usato per rilevare le cellule senescenti, sia in coltura che in vivo. Questa analisi è basata sul contenuto lysosomal aumentato nelle cellule senescenti, che permette la rilevazione istochimica di attività lisosomiale della β-galattosidasi a pH trovata (6 o 5.5). In confronto con altri dosaggi, come la citometria a flusso, ciò permette l’individuazione delle cellule senescenti nel loro ambiente residente, che offre importanti informazioni come la posizione relativa all’architettura del tessuto, la morfologia e la possibilità di abbinamento con altri marcatori tramite immunoistochimica (IHC). La limitazione principale del saggio SA-β-gallone è il requisito di campioni freschi o congelati.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per comprendere la senescenza cellulare come promuove la rigenerazione di tessuto e plasticità cellulare in vivo. Utilizziamo SA-β-gallone per rilevare cellule senescenti in muscolo scheletrico dopo un danno, che è un sistema ben consolidato per studiare la rigenerazione dei tessuti. Inoltre, utilizziamo IHC per rilevare Nanog, un marcatore delle cellule staminali pluripotenti, in un modello di topo transgenico. Questo protocollo consente di esaminare e quantificare la senescenza cellulare nel contesto della plasticità cellulare indotto e in vivo di riprogrammazione.
Introduction
La senescenza cellulare è una forma di risposta allo stress, caratterizzata da un arresto del ciclo cellulare stabile. Nell’ultimo decennio, la ricerca ha fermamente stabilito che la senescenza è associata con vari processi biologici e patologici, compreso lo sviluppo embrionale, la fibrosi e organismo invecchiamento1,2. La senescenza cellulare è stata identificata in fibroblasti umani alla fine della loro durata di vita ripetitiva innescato da3di riduzione del telomero. Oltre lo stress ripetitivo, ci sono molti altri stimoli che possono indurre senescenza, inclusi danni DNA, stress ossidativo, segnali oncogenici e alterazioni genomiche/epigenomic, che alla fine può attivare le vie p53/p21 e/o pRB stabilire e rafforzare la crescita permanente arresto1. Una delle caratteristiche importanti delle cellule senescenti è che essi rimangono metabolicamente attive e robustamente esprimere un fenotipo secretivo senescenza-collegata (SASP): secrezione di molte citochine infiammatorie, fattori di crescita e matrice extracellulare fattori4. SASP fattori sono stati proposti a giocare un ruolo importante nel mediare e amplificando l’effetto di senescenza, dovuto i loro effetti potenti su attirando le cellule immuni e alterazione del tessuto locale e sistemica ambienti1. È interessante notare che, senescenza è stato recentemente proposto per essere importante per tessuto riparazione e rigenerazione5,6. Inoltre, i dati da diversi laboratori, compreso il nostro, ha suggerito che la senescenza indotta da danni del tessuto potrebbe migliorare la plasticità cellulare, via SASPs, per promuovere la rigenerazione7–9. Di conseguenza, tutti i dati emergenti evidenziano l’importanza di studiare la senescenza in vivo.
Nell’era post-(iPSC) sulle cellule staminali pluripotenti indotte, plasticità cellulare è la capacità di una cellula di acquisire una nuova identità e di adottare un destino alternativo quando esposto a stimoli diversi nella cultura ed in vivo10. È noto che la riprogrammazione completa può essere raggiunto in vivo11,12, dove l’espressione della la cassetta contenente quattro fattori Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4e c-Myc (OSKM) può essere indotta in vivo per promuovere la formazione di teratomi negli organi multipli. Di conseguenza, un modello di topo riprogrammabile (i4F) utilizzabile come un potente sistema per identificare i regolatori critici e vie che sono importanti per plasticità cellulare11.
Un sistema adatto e sensibile in vivo è essenziale per capire la senescenza cellulare come regola la plasticità cellulare nell’ambito della rigenerazione dei tessuti. Qui, presentiamo un sistema robusto e un protocollo dettagliato per valutare il collegamento tra senescenza e plasticità cellulare nell’ambito della rigenerazione dei tessuti. Il danno muscolare di combinazione di con (CTX) indotta nel gruppo del muscolo tibiale anteriore (TA), un sistema ben consolidato per studiare la rigenerazione dei tessuti e il modello del mouse i4F, permette la rilevazione della senescenza cellulare sia in vivo riprogrammazione durante la rigenerazione del muscolo.
Per valutare il collegamento tra plasticità cellulare e senescenza, i4F topi sono feriti con CTX per indurre il danno muscolare acuto e trattati con doxiciclina (0,2 mg/mL) per 7 giorni per indurre in vivo riprogrammazione. Mentre un CTX indotta danno muscolare acuto e protocollo di rigenerazione è stato recentemente pubblicato13, per motivi etici, questa procedura verrà omesso nel protocollo corrente. Saranno raccolti campioni di muscolo TA a 10 giorni post infortunio13, quando il picco delle cellule senescenti sono state precedentemente osservate14. Qui, questo protocollo dettagliato descrive tutti i passaggi necessari per valutare il livello di senescenza (via SA-β-gallone) e riprogrammazione (via IHC che macchia di Nanog).
Dosaggio di beta-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone) è il test più comunemente usato per rilevare cellule senescenti entrambi nella cultura ed in vivo15. Rispetto ad altre analisi, il dosaggio di SA-β-gallone permette l’identificazione delle cellule senescenti nel loro ambiente nativo con architettura di tessuto intatto, che è particolarmente importante per lo Studio in vivo . Inoltre, è possibile accoppiare il saggio SA-β-gallone con altri marcatori utilizzando IHC. Tuttavia, il dosaggio di SA-β-gallone richiedono campioni freschi o congelati, che rimane una limitazione importante. Quando i tessuti freschi o surgelati sono ordinariamente disponibili, come i campioni di muscolo TA congelati, SA-β-gallone è ovviamente il dosaggio più adatto per rilevare cellule senescenti. Nanog è il marcatore utilizzato per rilevare le cellule riprogrammate per due motivi: 1) è un indicatore essenziale per la pluripotenza; 2) più importante, l’espressione non è guidato da doxiciclina (dox), pertanto si rileva pluripotenza indotta piuttosto che l’espressione forzata della cassetta Yamanaka.
È importante notare che i protocolli di colorazione presentati in questo studio possono essere condotto separatamente per semplificare la procedura di quantificazione, ma possono anche essere fatto in una procedura di co-colorazione per visualizzare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti sulla stessa sezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un metodo per rilevare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti in muscolo scheletrico di topi riprogrammabili. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per valutare e quantificare sia senescenza e indurre la plasticità cellulare in vivoed esaminare il ruolo della senescenza in rigenerazione e riparazione tissutale.
Nel protocollo attuale, l’analisi di β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone) è usata per rilevare in vivo le cellule …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Clemire Cimper per il suo eccellente supporto tecnico. Lavoro nel laboratorio di H.L. è stato finanziato dal Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche scientifica e l’Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d’Excellence Revive, Investissement d’Avenir; ANR-10-LABX-73), l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) e la Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. e C.A. sono finanziate con il dottorato di ricerca e borse di studio post-dottorati dal Consorzio rivivere.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
Referencias
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