La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra
Summary
Se implementó una combinación de las técnicas de microscopía con largo excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda del láser ópticas avanzadas para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales en tiempo real de la migración de la cresta neural en Tg (sox10:EGFP) y los embriones de pez cebra de Tg (foxd3:GFP).
Abstract
Ojo congénita y anomalías craneofaciales reflejan alteraciones en los nervios de la cresta, una población transitoria de células migratorias que dan lugar a numerosos tipos de células en todo el cuerpo. Entender la biología de la cresta neural ha sido limitada, lo que refleja una falta de modelos genéticamente manejables que pueden ser estudiado en vivo y en tiempo real. Pez cebra es un modelo de desarrollo particularmente importante para el estudio de las poblaciones de células migratorias, como la cresta neural. Para examinar la migración de la cresta neural en el ojo en desarrollo, se implementó una combinación de las técnicas ópticas avanzadas de láser, microscopía de excitación de fluorescencia de varios fotones de onda larga para capturar videos de alta resolución, tridimensionales en tiempo real del ojo en desarrollo en embriones de pez cebra transgénico, es decir, Tg (sox10:EGFP) y Tg (foxd3:GFP), como sox10 y foxd3 han demostrado en numerosos modelos animales para regular la diferenciación temprana de la cresta neural y probablemente representan los marcadores para células de la cresta neural. La proyección de imagen multi-photon Time-lapse fue utilizada para discernir el comportamiento y los patrones migratorios de dos poblaciones de células de cresta neural que contribuye al desarrollo temprano del ojo. Este protocolo proporciona información para la generación de vídeos Time-lapse durante la migración de la cresta neural del pez cebra, como un ejemplo y puede aplicarse más para visualizar el desarrollo temprano de muchas estructuras en el pez cebra y otros organismos modelo.
Introduction
Enfermedades congénitas oculares pueden causar ceguera de la infancia y a menudo debido a las anormalidades de la cresta neural craneal. Las células de la cresta neural son células transitorias que surgen a partir del tubo neural y forman numerosos tejidos en todo el cuerpo. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 las células de la cresta Neural, derivadas del prosencéfalo y mesencéfalo, dan lugar a los huesos y el cartílago de la cara y regiones frontales, iris, córnea, red trabecular y esclera en el segmento anterior del ojo. 4 , 6 , 7 , 8 células de la cresta Neural desde el rhombencephalon forma que arcos de la faringe, mandíbula y tracto de salida cardíaco. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 estudios han puesto de relieve las aportaciones de la cresta neural para ocular y periocular desarrollo, haciendo hincapié en la importancia de estas células en el desarrollo del ojo vertebrado. De hecho, alteración de la diferenciación y migración de células de cresta neural conducen a anomalías craneofaciales y oculares como se observa en el síndrome de Axenfeld-Rieger y síndrome de Peters Plus. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 por lo tanto, una comprensión global de la migración, proliferación y diferenciación de estas células de la cresta neural se proporciona la penetración en la complejidad subyacente a enfermedades oculares congénitas.
El pez cebra es un organismo modelo de gran alcance para estudiar desarrollo ocular, como las estructuras del ojo de pez cebra son similares a sus contrapartes mamíferas, y muchos genes son conservados evolutivamente entre pez cebra y mamíferos. 18 , 19 , 20 además, embriones de pez cebra son transparentes y ovípara, facilitando la visualización del desarrollo del ojo en tiempo real.
Ampliando el trabajo previamente publicado,6,7,20 el patrón migratorio de las células de la cresta neural fue descrito usando múltiples fotones fluorescencia Time-lapse de imagen en líneas de pez cebra transgénico con proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control transcripcional de SRY (sex-determining región Y)-caja de 10 (sox10) o caja del Forkhead D3 regiones reguladoras del gen de (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. proyección de imagen de múltiples fotones fluorescencia Time-lapse es una técnica poderosa que combina las técnicas ópticas avanzadas de láser microscopía con larga excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales de las muestras etiquetadas con fluoróforos. 25 , 26 , 27 el uso del multi-photon laser tiene distintas ventajas sobre el estándar microscopia confocal, incluyendo penetración creciente del tejido y disminución fluoróforo blanqueo.
Usando este método, dos poblaciones distintas de las células de la cresta neural varía en el momento de la migración y vías migratorias fueron las células de la cresta neural es decir positivo de foxd3, discriminados en el mesenchyme periocular y el ojo en desarrollo y sox10-positivo de la cresta neural células de mesénquima craneofacial. Con este método, se introduce un enfoque para visualizar la migración de migración de la cresta de los nervios oculares y craneofacial en el pez cebra, lo que es fácil observar la migración de la cresta neural regulado en tiempo real durante el desarrollo.
Este protocolo proporciona información para la generación de vídeos Time-lapse durante el desarrollo temprano del ojo en Tg (sox10:EGFP) y Tg (foxd3:GFP) de pez cebra transgénico, por ejemplo. Este protocolo se puede aplicar aún más para la visualización de alta resolución, tridimensional en tiempo real del desarrollo temprano de cualquier estructura ocular y craneofacial derivado de las células de la cresta neural en el pez cebra. Además, este método puede ser aplicado además para la visualización del desarrollo de otros tejidos y órganos en el pez cebra y otros modelos animales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La proyección de imagen multi-photon Time-lapse permite el seguimiento en vivo de poblaciones celulares transitorias y migratorias. Esta poderosa técnica se puede utilizar para el estudio de los procesos embrionarios en tiempo real, y en el presente estudio, los resultados de este método mejorado el conocimiento actual de la migración de células de cresta neural y el desarrollo. Anteriores estudios Time-lapse de imágenes típicamente utilizan la microscopía de láser confocal. 29 <…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Thomas Schilling para amablemente regalar el pescado Tg (sox10:eGFP) y Mary Halloran para amablemente regalar pescado Tg(foxd3:GFP) .
Materials
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope – FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
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